生物细胞作用(6篇)
时间：2024-05-15
时间：2024-05-15
摘要自1981年Siegel提出细胞免疫系统的新概念以来[1]，红细胞免疫在运动医学与运动人体科学领域引起了广泛关注。红细胞不仅作为人体血液中重要的组成成分，在人体免疫系统中也发挥着举足轻重的作用。本文对红细胞免疫功能、测定方式进行说明的同时，也对近年来运动对红细胞免疫的影响做进一步的概括。
关键词运动红细胞免疫研究
一、红细胞的免疫功能
国内外对红细胞的免疫功能做了大量研究，现在已经趋于成熟。红细胞重要的免疫功能与自身免疫物质是分不开的。红细胞主要的免疫物质有：补体受体CR1、淋巴细胞功能抗原-3、人类补体膜辅助因子蛋白、过氧化酶、过氧化物歧化酶、降介加速因子、I因子、红细胞免疫粘附抑制因子、红细胞免疫粘附促进因子。其免疫作用主要有以下几点。
（一）粘附、清除免疫复合物
红细胞免疫功能重要的物质基础是补体受体CR1，即红细胞C3b|C4b受体[2]。正常红细胞表面CR1能够黏附抗原—抗体—补体形成的免疫复合物以及抗原补体复合物。CR1是单链糖蛋白，在红细胞膜上成簇存在，它可以与循环免疫复合物（CIC）中的C3b可逆结合，这种结合受CR1浓度的影响。结合免疫复合物以后的红细胞（RBC-IC）随血液到达肝、脾后，肝、脾中的巨噬细胞的CR1浓度比红细胞的高，可将IC从低浓度CR1的红细胞上夺取过来，进行吞噬。红细胞与IC分离后重新进入血液。此外，CR1通过免疫复合物抗体的Fc段与吞噬细胞的Fc段受体结合，增强吞噬细胞的吞噬作用[3]。因此，CR1的桥梁作用使红细胞在粘附、清除免疫复合物时起重要作用。
（二）发挥自身免疫效应
红细胞膜上的CR1与C3b结合后，自身释放某些酶（比如过氧化物酶和氧化酶）杀伤红细胞表面的微生物。
（三）参与特异性免疫与非特异性免疫调节
红细胞上的免疫物质通过特异性或非特异性免疫参与调控。红细胞不仅对抗原呈递、加工，还可产生NK细胞增强因子，增强NK细胞的毒效应，在抗感染、抗肿瘤及保护机体重要蛋白质和DNA免遭氧化损伤中其重要作用[4]。红细胞促进T淋巴细胞产生IL-2受体，增强T淋巴细胞的免疫功能。此外，红细胞促进B细胞增殖和免疫球蛋白Ig的合成，这种作用是同LFA-3与T细胞的CD3分子相互作用，T细胞的CD3分子增强B细胞应答。
（四）参与自身细胞因子产生的调控
体外实验表明，红细胞可促进自身单个核细胞产生IL-2、IL-3，集落刺激因子，IL-6，IL-8a，肿瘤坏死因子，IL-1等细胞因子[5]。其主要机制是红细胞膜表达的CD58分子，是单个核细胞表面CD2分子的天然配体，二者结合是红细胞具有调控作用的主要物质基础。红细胞上存在大量IL-8受体（即Duffy血型抗原），该受体能将血中的IL-8等趋化因子迅速地从血浆中清除掉，IL-1、IL-6和TNF等炎症细胞因子的作用必须以IL-8因子为中介。因此，内环境中IL-8分子的浓度与炎症发生的快慢及严重程度有重要关系。
三、红细胞免疫测定的指标
（一）红细胞C3b受体花环实验
红细胞C3b花环率主要测定红细胞C3b受体（即CR1）的活性，根据其活性变化反映红细胞免疫功能的状况。CR1在红细胞发挥粘附清除功能时发挥重要作用。因此CR1的活性的高低是反映红细胞免疫能力强弱的一个敏感且具有代表性的指标。C3b一方面共价结合与抗原或免疫复合物，另一方面有作为配体与细胞表面的受体CR1相结合，触发免疫细胞对异物及抗原的黏附和清除[6]。红细胞C3b受体花环率主要测定其活性，根据其活性的变化反映红细胞免疫功能的状况。
（二）红细胞免疫复合物花环率
红细胞免疫复合物花环率主要测定红细胞黏附免疫复合物的能力，并间接反映出循环免疫复合物的水平变化。免疫复合物可以激活补体，产生的C3b转脂反应后可以嵌入到免疫复合物网络结构中形成红细胞免疫复合物，并被红细胞CR1识别、粘附。形成的免疫复合物占据CR1的位点，所以红细胞免疫复合物实验结果反映的是免疫复合物通过CR1-C3b联结结合于红细胞上的情况。形成的免疫复合物越多红细胞的免疫能力越低。
四、不同强度运动对红细胞免疫的影响
（一）长时间大强度运动与红细胞免疫
长时间大强度运动使红细胞免疫力下降。裴新贞等[7]得出的结论：长时间大强度运动后，SD大鼠的红细胞免疫粘附功能下降。可能的原因是长时间剧烈运动时，机体处于高氧状态，氧自由基过多，使红细胞结构受损，红细胞流变性发生变化。大强度的运动使血液中β-内啡肽增多，而红细胞上有β-内啡肽受体即阿片肽。实验证明，β-内啡肽对红细胞粘附作用有正负调节作用，β-内啡肽与阿片肽结合而改变CR1构象，从而调节CR1粘附作用。
（二）适中强度运动与红细胞免疫
张利朝等人指出红细胞免疫能力与红细胞数量有一定的关系[8]；田石榴[9]等通过实验研究也得出适当的运动量会提高红细胞的免疫指数。前人的报告结论是一致的，这些对运动训练提供一定的理论指导。
（三）力竭运动与红细胞免疫功能
动物实验研究发现长时间剧烈至力竭运动后引发继发性的免疫功能下降从而造成SD大鼠继发性红细胞免疫功能下降，且长时间未能恢复至安静时水平，处于免疫抑制状态[10]。流行病学调查结果显示，长时间剧烈运动会损害机体免疫能力，表现为对感染性疾病的易感性增加，从而使运动员的健康水平和运动能力发生不同程度的下降。
目前，国内、外对运动与红细胞免疫功能研究还有待深入进行研究，了解运动中红细胞的免疫功能的变化及其恢复特点，对科学地指导大众健身运动、运动训练与体育教学具有重要的意义。
参考文献：
[1]SiegelI，LinTL，Gieicher.Theredcellimmunesystem.Lancet.1981.2（8246）：556.
[2]娄世锋，黄宗干.红细胞CR1结构、功能及临床意义[J].国外医学临床生化与检测学分册.1990.11（5）：527.
[3]王淑英，汪德清.红细胞膜上CR1分子的研究进展[J].中国输血杂志.2010.23（2）：143.
[4]姜振，周忠.运动与红细胞免疫[J].中国体育科技.2003.39（6）：24.
[5]王海滨，郭峰.红细胞参与自身细胞因子调控的研究进展[J].国外医学免疫学分册.1999.（5）：2632266.
[6]施鹏，许冬明，黄美蓉.运动与红细胞免疫[J].中国临床康复.2004.8（33）：7255.
[7]裴新贞，陈文鹤，郭峰.口服氨基酸与大强度运动对红细胞免疫功能的影响[J].深圳中西医结合杂志.2001.11（6）：337.
[8]张利朝，张盈华，陈渝宁，等.健康人运动前后红细胞免疫功能与细胞数的变化及关系[J].细胞与分子免疫学杂志.2001.17（2）：187.
【关键词】复方木鸡冲剂肝细胞癌凋亡分化
Studyoninhibitionproliferationanddifferentiation
【Abstract】ObjectTostudytheinhibitioneffectandmechanismofMujiChongjionhepatocarcinomacelllineHepG2.MethodsMTTassaywasadoptedtodescribetheproliferationofcarcinomacells.ApoptosisinducedbyMujiChongjiwasinvestigatedbyapplyinglightmicroscopyandflowcytometry(FCM)，Thecontentsofγ-glutamyltranspeptidase(γ-GT)andalkalinephosphatase(ALP)inthesupernatantweredeterminedbybiochemistrytechniques，α-fetoprotein(AFP)wasdetectedbyradioimmunoassay.Immunohistochemicalstainingwasperformedtodeterminetheproteinofp21WAF1.Results：OurresultsshowedMujiChongjireducedHepG2cellviabilityobviously(p
【Keywords】MujiChongji;HepG2cellline;apoptosis;differentiation
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤，死亡率很高。在发展中国家发病率占全球肝癌病例80%以上而我国发生的肝癌占全世界发病率的42.5%[1]。目前肝癌的药物治疗中是以化学药品为主，但化学药品的开发费用昂贵，毒副作用大，多有不同程度的致突变毒性。因此，人们把目光转向中药，试图从天然成分中寻找毒副作用小。作用独特的抗肿瘤药物。复方木鸡冲剂[2-3]是我国传统的珍贵药材，具有抑制甲胎蛋白升高和调节免疫功能的作用，已用于临床治疗肝硬化、肝炎等肝脏疾病，但对该药抗肿瘤作用机制的研究很少，本实验通过复方木鸡冲剂对人肝癌细胞系HepG2作用的系列分析及与细胞凋亡和分化的关系。探讨该药的抗肿瘤效应，为中药在肿瘤治疗中的应用提供参考。
1材料
1.1细胞株人肝母细胞瘤HepG2细胞由大连医科大学病理生理教研室冻存保种。细胞接种于含10％FBS的DMEM全培养基中，在37℃，5％CO2饱和湿度孵箱中孵育，2～3天传代一次，待细胞铺满瓶底的80％～90％时进行传代。传代时用胰蛋白酶进行消化，使细胞与瓶壁脱离，加全培基终止消化，制成单个细胞悬液，取对数生长期细胞用于实验。
1.2主要试剂和仪器L-DMEM(GIBCOU公司），胎牛血清（FBS，ISRAEL公司），Caspase3、Bcl-2、P21WAF1单抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，复方木鸡冲剂（丹东药业有限公司，批号31203），β-榄香烯（大连金港制药厂），MTT（华美生物工程公司），AnnexinV/PI（南京凯基生物科技发展有限公司），流式细胞仪(FACSCalibur，BD公司)，全自动酶标仪（MultiskanAscentV1.24Clin-Bio120C）。
2方法
2.1MTT法检测HepG2细胞增殖活性取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，离心1000rpm，5min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM培养液制备成浓度为1×105/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100ul。实验设空白对照组，阳性药物对照组（β-榄香烯）及木鸡冲剂组，每组设4个平行孔，于37℃，5%CO2条件下分别培养24h、48h、72h后，每孔加15ulMTT液，避光继续培养4h后离心，弃上清，加DMSO150ul/孔，在自动酶标仪上以570nm波长测定各孔OD值，计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率:抑制率=(1-实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100%
2.2细胞形态学观察取复方木鸡冲剂作用24h、48h和72h后的HepG2细胞涂片，自然凉干，瑞氏-姬姆萨染色，显微镜下观察细胞的形态，常规培养细胞作空白对照。
2.3流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测收集经复方木鸡冲剂处理24h和72h的HepG2细胞（1～5×106），预冷PBS液洗两遍，吸取250ul的1×BindingBuffer和250ul灭菌去离子水，混匀，用上述500ul的1×BindingBuffer悬浮细胞，加入1ulAnnexinV-EGFP，混匀后加入5ulPI，混匀，室温下避光反应15min后上机检测凋亡发生情况。
2.4全自动生化分析仪检测GGT、ALP收集药物作用48h的HepG2细胞，经全自动生化分析仪检测GGT、ALP含量，与常规培养细胞的上清液比较，实验重复三次，计算平均值。
2.5HepG2细胞AFP分泌量的测定收集药物作用48h后的HepG2细胞，用放射免疫测定法检测AFP的含量，常规培养HepG2细胞上清液的AFP含量为对照，实验重复三次，计算平均值。
2.6免疫细胞化学方法检测细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子P21WAF1的表达对数生长期的HepG2细胞经5%的复方木鸡冲剂作用24h、48h和96h后，收集细胞，pH7.4PBS洗涤3次，将细胞悬液均匀涂抹于防脱片剂处理的载玻片上，干燥后冷丙酮4℃固定10min，3%过氧化氢室温作用10min，非免疫兔血清封闭20min，按试剂盒要求加入P21WAF1单抗，4℃孵育过夜，pH7.4PBS洗涤3次，然后与生物素标记的抗羊IgG，室温孵育15min，pH7.4PBS漂洗后，加链酶亲和素-碱性磷酸酶溶液（SABC-AP），室温下反应20min，pH7.4PBS洗涤3次，加入新鲜配制的DAB显色10min，苏木素复染，梯度酒精脱水后，中性树胶封片，以pH7.4PBS代替一抗为空白对照。显微镜下观察药物作用后P21WAF1蛋白的表达情况。
3结果
3.1复方木鸡冲剂对HepG2细胞生长的影响经复方木鸡冲剂处理后HepG2细胞的生长明显低于空白对照组（p＜0.01），见表1。24h的抑制率达63.0%，这种生长抑制作用不随时间的延长而增加（48h、72h的抑制率为49.6%和46.6%）。表1
复方木鸡冲剂对HepG2细胞的生长抑制情况
3.2复方木鸡冲剂处理后细胞形态的变化HepG2细胞为贴壁生长的细胞，经复方木鸡冲剂处理后细胞的密度与空白组比减少，细胞之间的连接疏松，培养液中细胞悬浮的增加，贴壁细胞明显减少。瑞氏-姬姆萨染色可见，经复方木鸡冲剂处理48h后的HepG2细胞形态由多角形转变为长梭形或树枝状，有突起伸出。细胞体积明显缩小，细胞核变小，固缩而深染，染色质凝集，核仁数目变少，肾形核多见，核浆比例降低，细胞分裂相减少。
3.3复方木鸡冲剂对HepG2细胞诱导凋亡的作用HepG2细胞经复方木鸡冲剂作用后发生了凋亡的现象（表2，显示与空白对照组比p
3.4细胞培养上清中GGT、ALP和AFP浓度的变化经复方木鸡冲剂处理48h后，HepG2细胞培养上清液中GGT的浓度有所下降，但与处理前比无统计学差异(表3，p﹥0.05)；ALP的浓度在药物处理48h后，明显升高(表3，p﹤0.05)。经复方木鸡冲剂处理后HepG2细胞AFP分泌量明显降低(与处理前比p
培养上清中GGT、ALP含量的变化注：木鸡冲剂组VS空白对照组，P＜0.05。
3.5复方木鸡冲剂对HepG2细胞p21WAFI蛋白表达的影响免疫细胞化学检测可见常规培养的HepG2细胞内p21WAFI蛋白表达较弱，呈弱阳性显色反应，浅黄色反应产物主要分布于细胞质中，核内仅有微量分布。经复方木鸡冲剂处理的HepG2细胞p21WAFI蛋白表达明显增强，为强阳性反应，反应产物为深棕黄色，细胞质内p21WAFI蛋白表达产物明显增加，主要分布于核周边细胞质区域，细胞核内的蛋白分布也明显增多，结果见图1。
4讨论
恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一，据WHO统计，每年约有200万人患癌，约80万人接受化学治疗，寻找有效的抗癌药物和方法，是世界医学面临的重要课题。医学界在寻求和使用抗癌药物的同时发现，许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，且临床上用于治疗肿瘤的化学药物大多数品种都有不同程度的致突变遗传毒性，因此治疗肿瘤的同时增加了病人患第二种肿瘤的可能性，而植物类药的遗传毒性似乎不太明显。因此，从天然物质中寻找毒副作用小、安全有效的抗肿瘤药物成为近些年的研究热点。
本实验采用MTT法观察药物作用不同时间后，对HepG2细胞增殖的影响，确定生长受到明显抑制的药物起效时间。实验结果显示，复方木鸡冲剂对HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用，但未显示出时间依赖性。在作用24h时基本上达到高峰处于稳定状态。经细胞凋亡检测证实，复方木鸡冲剂对HepG2细胞增殖的抑制作用与诱导细胞凋亡有关。
AnnexinV+/PI-双染法是检测细胞凋亡早期变化和晚期改变的方法之一。Annexin-V可以与早期凋亡时翻转到细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合[4]，PI（碘化丙啶）在细胞凋亡晚期透过细胞膜而使细胞核染成红色。AnnexinV-FITC与PI联合使用，就可以将早期凋亡细胞(AnnexinV+/PI-)和晚期凋亡细胞以及坏死细胞(AnnexinV+/PI+)区分开来[5]。实验结果表明，复方木鸡冲剂作用HepG2细胞24h后早期凋亡率和晚期凋亡率相当；药物作用72h后，主要表现为晚期凋亡和坏死，这一结果提示，复方木鸡冲剂诱导细胞凋亡的过程比较慢。坏死细胞百分比的增加是由于培养体系中没有吞噬细胞，凋亡的细胞最终发生了崩解。
进一步的深入研究发现，复方木鸡冲剂对HepG2细胞增殖的抑制作用还与诱导细胞分化有关。恶性肿瘤细胞在形态、功能等方面都类似于未分化的胚胎细胞，大多数学者认为失控的增殖是许多恶性肿瘤的基本特征，而肿瘤细胞诱导分化治疗是肿瘤治疗研究的新途径，其基本特点在于不单是杀伤肿瘤细胞而是诱导细胞分化为正常或接近正常细胞[6]。细胞形态是客观反映细胞分化情况的指标之一。复方木鸡冲剂处理后的HepG2细胞，由多角形转变为长梭形或树枝状，有突起伸出。细胞体积明显缩小，细胞核变小，固缩而深染，染色质凝集，核仁数目变少，肾形核多见，核浆比例降低，细胞分裂相减少，提示细胞开始恢复分化。另一方面能反映肝细胞分化的酶和蛋白[7]的测定结果显示，经复方木鸡冲剂处理后HepG2细胞分泌肝细胞增殖标志的酶GGT降低，分泌肝细胞分化标志的酶ALP增加，合成肝癌细胞的肿瘤标志物AFP减少，说明HepG2细胞经复方木鸡冲剂作用后其恶性程度明显降低。
对于复方木鸡冲剂诱导肿瘤细胞分化机理的研究我们采用了免疫细胞化学的方法测定p21WAFI蛋白表达。p21WAFI是细胞周期素依赖性激酶(CDK)的抑制因子，己知p21WAFI的表达调控与抑癌基因p53密切相关。p53蛋白的积聚，可使细胞停滞于G1晚期，目前认为p53蛋白的这种作用是通过调节p21WAFI的基因表达来实现的，p53通过与p21WAFI编码区上游的p53结合点的结合，以促进p21WAFI的表达[8]。p21WAFI可抑制CDK和PCNA，阻断细胞周期进程，在某些肿瘤细胞，p53基因突变，p21WAFI表达水平极低，导致细胞增殖失控[9]。在诱导分化研究中发现，无论哪个分化系均发现p21WAFI蛋白和mRNA增加，p21WAFI是细胞分化必需因子。实验中用复方木鸡冲剂处理HepG2细胞后发现，p21WAFI表达较空白对照组显著升高，提示复方木鸡冲剂可通过促进抑癌基因p21WAFI的表达，抑制细胞增殖，促进细胞分化。
参考文献
[1]NeuzilJ，WeberT，GellertN，etal.Selectivecancercellkillingbyalpha-tocopherysuccinate[J].BrJCancer，2001，84(1):87～89.
[2]朱蕴娟．东方芸芝胶囊联合复方木鸡冲剂治疗Ⅱ期原发性肝癌32例临床报告[J]．上海中医药杂志，1994，10：43．
[3]张宝初，王墨荣．复方木鸡冲剂治疗甲胎蛋白阳性54例分析[J]．中西医结合杂志，1998增刊（下）：194～195．
[4]BoersmaAW，NooterK，OcstrumRG，etal.QuantificationofapoptoticcellswithfluoresceinisothiocyanatelabeledannexinVinChinesehamsterovarycellculturestreatedwithcisplatin.Cytometry，1996，24:123～130.
[5]李容，刘晓力．双向凝胶电泳分析三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡[J]．癌症，2004，23（10）：1155～1160．
[6]李鹏，李祺福．肿瘤治疗的新途径——中药有效成分诱导恶性肿瘤细胞分化[J]．生物学通报，2002，37（3）：8～11．
[7]司维柯，李招权，张玮，等．苦参碱诱导HepG2细胞分化相关代谢指征的变化[J]．肿瘤研究与临床，2001，37（3）：223～225．
[8]ChoisyRC，RcisdorfP，YonishRE，etal.Mechanismofp53-inducedapoptosis:insearchofgenewhichareregulatedduringP53-mediatedcelldeach[J].Toxicol，1998，102:491～496.
一、抗病毒化学药物的危害性
r业部规定兽医临床上禁止使用抗病毒化学药物（如金刚烷胺金刚乙胺阿昔洛韦利巴韦林病毒灵等），因为抗病毒化学药物具有很大的危害性。
许多病毒对现有的抗病毒化学药物都能产生耐药变异毒株，甚至出现依赖药物的变异而使抗病毒化学药物效果不佳或者无效。
对动物机体产生损害作用抗病毒化学药物在临床上使用，对动物机体的器官与免疫细胞会产生毒害作用，诱发免疫抑制，降低动物的免疫力与抗病力如病毒灵对动物机体细胞有毒害作用；金刚烷胺金刚乙胺与阿昔洛韦对动物的肾功能有损害作用；利巴韦林易产生免疫抑制，并引发贫血与白细胞减少，降低动物机体免疫力与抗病力。
动物长期使用抗病毒化学药物，可间接对人体造成危害，威胁人类健康如利巴韦林在动物身上长时间使用，导致药物残留，再转移给人体，对人具有很强的致畸作用。
抗病毒化学药物能抑制病毒的增殖与扩散，但不能阻止病毒感染，也不能使机体将内毒素排出；病毒感染的早期使用有一定的效果，且只能治标不能治本。
二、目前兽医临床上常用的抗病毒药物简介
1.抗病毒细胞因子制剂
干扰素是机体受病毒或其他干扰素诱生剂刺激巨噬细胞淋巴细胞以及体细胞产生的具有高活性的多种生物学功能的糖蛋白（多种生物学活性的细胞因子）在正常机体的脾脏、肝脏、肾脏、外周血淋巴细胞和骨髓中都可以检出。
免疫核糖核酸是淋巴细胞和巨噬细胞受特异性抗原刺激后，产生的免疫信息遗传物质它能将供体对某些抗原的特异性免疫信息传递给受体的T细胞和B细胞，使之产生特异性致敏淋巴细胞和抗体，从而提高受体的免疫功能IRNA本身无免疫原性无种属特异性，不引发过敏反应或毒性反应一方面它具有传递免疫信息的功能，另一方面IRNA与抗原结合后，变成了超级抗原，可大大地增强免疫功能IRNA具有广谱的抗病毒作用，可用于各种动物病毒性疾病的防治。
免疫球蛋白是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，存在于哺乳动物和人类的血液组织液及外分泌液中，在动物机体的营养代谢和生理调节方面具有重要的作用，是动物体内免疫系统最关键的组成物质之一。Ig具有抗病毒抗外毒素杀灭细菌中和毒素等多种生物学活性其生物学功能主要表现在与相应抗原特异性结合，激活补体，结合细胞产生多种生物学表达，并通过胎盘传递免疫力在保护肠道呼吸道泌尿生殖道乳腺五官等黏膜器官的细菌与病毒入侵时起关键作用；能凝集颗粒性抗原，中和病毒粒子，介导宿主细胞免疫，增强机体的免疫功能与抗病力。
转移因子是将预先用特异抗原致敏的T淋巴细胞（脾脏与淋巴结等）反复冻融，经过透析与超滤后，所获得的一种小分子核苷酸与小分子多肽的复合物由于它能将供体某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体，故称为转移因。
白细胞介素是由活化的单核-巨噬细胞及淋巴细胞等所产生的一类细胞因子，它是淋巴细胞、巨噬细胞与其他细胞间相互作用的介质，负责信号传递联络白细胞群的相互作用，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。白细胞介素与相应细胞的结合，这种连续的细胞因子与细胞间相互作用，可以扩大和调节免疫应答。
胸腺是免疫系统的中枢器官，可分泌一系列具有免疫活性的多肽类物质，总称为胸腺激素其中包括胸腺肽（胸腺素，TM）、血清胸腺因子（STF）、胸腺生成素（TP）及胸腺体液因子（THF）等。
2.其他抗病毒药物
聚肌胞（又称聚肌苷酸）是一种高效的干扰素诱生剂，具有广谱抗病毒作用与免疫节功能，可用于防治犬传染性肝炎与家兔病毒性出血症、病毒性肝炎与单纯疱疹病毒性角膜炎以及动物带状疱疹病毒感染等。
阿糖腺苷嘌呤核苷同系物，能抑制病毒多聚酶从而阻断病毒的合成，可用于防治猪伪狂犬病、疱疹病毒性感染、巨细胞病毒性脑炎、水痘病毒感染及奶牛的病毒病等。
植物血凝素是一种有丝分裂原，其主要成分为植物多肽，是一种低聚糖（由甘露糖氨基酸葡萄糖酸衍生物构成）与蛋白质的复合物，植物血凝素能刺激T淋巴细胞增殖与分化，产生大量的效应T细胞和细胞毒性T细胞.效应T细胞又可分泌大量的细胞因子（如干扰素等）杀伤病毒；细胞毒性T细胞可直接杀伤病毒.植物血凝素还可刺激B淋巴细胞转化为浆母细胞后增殖分化为浆细胞，浆细胞产生大量的非特异性抗体可中和病毒.植物血凝素还能激活免疫细胞，提高骨髓造血机能，提高机体白细胞与多核白细胞的产量，促进机体细胞诱生干扰素和抗体的形成，增强机体对病原微生物的吞噬作用，增强机体的免疫力与抗病力。
三、关于抗病毒药物的选择
1.选择抗病毒药物防治的原则
病毒必须在活细胞内寄生复制与繁殖，完全依赖于宿主细胞的生物合成，有一些病毒的核酸还能直接整合于宿主细胞之内因此，选择抗病毒药物一定要坚持个基本要求：一要能抑制或破坏细胞内外病毒的代谢与蛋白质的合成；二要对动物机体正常细胞不产生致死性损伤；三要不能使病毒产生耐药变异毒株；四要具有修复免疫缺陷和激活免疫抑制，提高动物免疫力和抗病力之功能目前，市场上流通的抗病毒化学药物虽然能抑制病毒的生物合成，阻止病毒穿入与释放，但是，抗病毒化学药物对动物机体正常细胞有严重的损害作用，降低机体的免疫力与抗病力。
2.针对病毒的生活周期选用抗病毒药物
病毒进入动物机体，其生活周期为：细胞外阶段，以成熟的病毒粒子的形式存在；细胞内阶段，即感染阶段，病毒进行繁殖其环节为吸附穿入脱壳生物合成成熟和释放等抗病毒药物通过阻止上述任何一个环节，就可达到阻止病毒穿入宿主细胞和干扰病毒增殖的目的选用中药制剂与细胞因子制剂用于防控动物的病毒性疾病，对上述任何一个环节都能发挥作用，最终达到阻止病毒吸附穿入脱壳；抑制病毒核酸转录与复制；抑制病毒蛋白合成与装配；阻断细胞受体，达到干扰病毒增殖的目的中药制剂与细胞因子制剂都具有抗病毒抗细菌抗应激改善机体免疫力的功能。
关键词：植物干细胞教学应用
干细胞是指具有自我更新能力和增殖分化能力的一类细胞，目前学习者对动物干细胞的理论和应用知识掌握较多。由于植物细胞的全能型，长期以来很多学习者误认为植物中不存在干细胞，再加上教师对干细胞这部分内容的讲授不透彻，造成学习者对植物干细胞、动物干细胞及植物愈伤组织细胞的概念往往混淆不清，存在植物干细胞认知上的错误，因此很有必要对植物干细胞的相关知识进行总结。
1.植物干细胞
1.1植物干细胞的概念和特征。植物干细胞是位于植物分生组织中固有的未分化细胞，具有自我更新和再生能力。植物干细胞具有很强的自我更新能力，并且可以分化为特化的细胞类型，这些特化的细胞产生新的植物器官（根、茎、叶和花等）。这些细胞表型的变化是由影响植物功能的基因表达变化引起的，受到内源性和外源性的信号共同调节[1]。植物干细胞的特征包括：能够形成所有分化细胞的类型；具有自我更新的能力，维持干细胞的数量；位于分生组织。
1.2植物干细胞与动物干细胞的比较。在动物中，通常将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有全能性，它可以分化形成所有的成体组织细胞，甚至发育成为完整的个体；成体干细胞（如造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞等）大多为多能干细胞，它们具有多向分化的潜能，可以分化形成除自身组织细胞外的其他组织细胞，真正具有全能性的细胞是受精卵和其分裂产生的子细胞。与此相比，许多植物干细胞具有旺盛的再生能力，在干细胞的整个生活周期中能使植物生长并且产生新的器官（如植物茎端分生组织中的干细胞和根端分生组织中的干细胞）[2]。
1.3植物干细胞与植物愈伤组织细胞的比较。植物愈伤组织细胞是由成体细胞经过脱分化而形成的具有分化能力的细胞，虽然愈伤组织的分化能力与植物干细胞相似，但它们在来源、细胞分化和增值能力等方面是不同的。植物愈伤组织细胞来源于异质性的体细胞，它是体细胞对损伤的暂时响应，是一个临时获得刺激的细胞，尽管愈伤组织具有干细胞样属性，但愈伤组织不易维持稳定的细胞分裂[3]。而植物干细胞来源于植物分生组织的同质性细胞，它们在植物的整个生命周期可以产生并形成新的组织和器官。
2.植物干细胞的类别与调控
根据分生组织的种类，植物干细胞可分为茎尖分生组织中的干细胞和根尖分生组织中的干细胞。
2.1茎尖分生组织中的干细胞。茎尖分生组织包括中心区和中心区下方的带状区。中心区包括上部干细胞区和下部的组织中心（即干细胞区下部靠近带状区的小细胞群）。干细胞分裂时上部的干细胞分裂成两部分子细胞，一部分干细胞后裔留在中心区并保持多能性；另一部分细胞则离开茎尖分生组织的中心区，但保持较快的分裂速度，最终分化为叶或者花原基器官，为侧生器官的生长和分化提供保证[4]。目前已知的位于干细胞周围“组织中心”的WUS（WUSCHEL）是保持茎尖干细胞特征的必要信号分子，它参与对茎尖干细胞的稳态调控，使整个植物茎尖干细胞保持连续不断的自我更新和分化。
2.2根尖分生组织中的干细胞。静止中心位于根尖分生组织中心，干细胞则围绕在静止中心细胞周围。静止中心作为组织中心维持周围干细胞的稳定和功能，静止中心周围的干细胞分布于中柱鞘外侧，维管干细胞形成维管组织、皮层/内皮层干细胞，进而形成皮层、内皮层与根冠干细胞，然后形成根冠细胞。目前已知的WOX5（WUS-RELATEDHOMEOBOX5）作为最主要的干细胞决定因子，特异的表达于根端分生组织的静止中心，参与对根端干细胞的稳态调控，使整个植物的根尖干细胞保持连续不断的自我更新和分化[4]。
3.植物干细胞的应用
3.1生产天然产物，开发药品或者化妆品。传统的植物细胞培养存在细胞生长缓慢、生产成本高等问题，而植物干细胞培养具有遗传稳定、细胞生长率和生长模式稳定、凝集程度低等优点，可以用来大量生产有用的植物天然产物，并用于药品、功能性食品、化妆品中。如悬浮培养紫杉干细胞可以生产松香烷型三环二萜、美丽红豆杉素A和美丽红豆杉素B等产物，以达到抑制肿瘤血管的生成和抗癌作用，而且其产值远大于传统细胞培养的产值，具有很好的开发前景[5]。
3.2植物细胞系库的建立和利用。一般的植物细胞冻存后存活率低，恢复生长能力慢，因此限制其在植物细胞培养中的应用。植物干细胞系在低温储藏方面有很大的优势，不仅有高的存活率，而且在低温储藏前后遗传物质没有变异，是植物细胞系库建立的很好材料。细胞系库的建立不仅会使研究材料的供应得到满足，而且使植物细胞系的研究周期缩短，并在植物种子资源的保存和利用方面发挥重要作用[6]。除了以上应用外，利用植物干细胞还可以进行植物干细胞的分子调控机制和分子设计育种等方面的研究。
4.结语
植物干细胞是位于植物分生组织中固有的未分化细胞，它们具有自我更新和再生能力。根据目前学习者对植物干细胞认识不足的实际，本文对植物干细胞、动物干细胞及植物愈伤组织细胞的概念进行了辨析，并对植物干细胞的分类及应用进行了论述。学习者清楚植物干细胞、植物愈伤组织细胞和动物干细胞的概念后，在学习植物干细胞的理论和应用等方面时才能正确理解相关的知识点。
参考文献：
[1]于荣敏，周良彬.食品与药品[J].2012，14（01）：52-55.
[2]李宝钧.哺乳动物干细胞的研究进展[J].畜牧业，2008，234（10）：24-27.
[3]游云，蒋超，黄璐琦.试析植物干细胞与动物干细胞的异同[J].中国中药杂志.2014，39（2）：343-345.
[4]田奇琳，赖钟雄.植物干细胞研究进展[J].园艺与种苗，2013（8）：56-62.
【摘要】目的对比研究姜黄素(curcumin)及其衍生物对脂多糖(lipopolysacchar，LPS)激活的小胶质细胞一氧化氮(NO)的产生及诱导型一氧化氮合酶((induciblenitricoxidesynthase，iNOS)表达的影响。方法用LPS(1μg·mL-1)刺激原代培养的大鼠小胶质细胞，同时用不同浓度姜黄素及其衍生物F进行干预，应用免疫组化方法观察细胞活性;Western-blot方法检测iNOS蛋白的表达;用Cayman'sNitrate/NitriteColorimetricAssayKit检测细胞上清液中NO的含量。结果LPS作用4h后，iNOS蛋白表达明显增强，NO释放量明显增加;使用姜黄素干预18h后，浓度在5μg·mL-1以上时可以显著抑制LPS激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达和NO的产生，但是姜黄素衍生物只有在浓度达到25μg·mL-1时才对iNOS蛋白的表达和NO的产生有明显的抑制效果。结论姜黄素和它的衍生物都能够抑制LPS激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达以及NO的产生，但其衍生物的作用相对较弱。
【关键词】姜黄素及其衍生物;iNOS;NO;LPS;小胶质细胞
姜黄素是从中药姜黄中提取的酚类物质。大量研究表明，姜黄素具有抗炎症、抗氧化、清除自由基等多种生物活性。目前姜黄素衍生物已成为国际新药开发领域的一个研究热点[1]。小胶质细胞是中枢神经系统长驻的巨噬细胞，在中枢神经系统的免疫反应中发挥核心作用。在感染因素如LPS等的刺激下，小胶质细胞被迅速激活。活化的小胶质细胞可诱导蛋白酶的激活，释放各种促炎性细胞因子，并生成大量活性氧和活性氮，iNOS便是其中之一。iNOS一旦被大量表达，其活性便可持续相当长时间，从而大量、持续产生NO，介导广泛的毒性作用，目前认为中枢神经系统炎症病人脑中反应性胶质细胞过度表达iNOS是造成神经元损伤的重要原因[2-4]。本研究对比观察了姜黄素及其衍生物对激活的小胶质细胞NO的释放和iNOS表达的抑制作用。
1材料和方法
1.1实验材料LPS、姜黄素、抗iNOS抗体、抗CD68抗体和抗GAPDH抗体购自Sigma公司;姜黄素衍生物由美国加州大学戴维斯分校邓文斌教授提供;NO测试盒购自美国CaymanChemical公司。
1.2实验方法
1.2.1小胶质细胞的分离和培养取1d龄的新生大鼠脑，去除结缔组织和血管，机械捣碎并通过70μm网筛过滤，分离的细胞种植到多聚赖氨酸包被的培养瓶中，培养于含20%小牛血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2恒温箱培养，每3d换1次细胞液。2周后，利用摇床振荡法分离纯化小胶质细胞，分离的小胶质细胞培养于含10%小牛血清的DMEM中。
1.2.2免疫组化方法小胶质细胞以1×106/孔接种于6孔板，内置无菌盖玻片，培养24h后，LPS或药物处理18h(用药物预处理细胞1h后加入LPS，共孵育18h)，吸去培养液，用预冷的PBS漂洗1次，4%多聚甲醛固定30min;PBS漂洗3次;与小胶质细胞特异性抗体抗CD68(1∶200)孵育过夜，然后再用PBS漂洗5min×3，最后加入荧光Alex-488偶联的辣根过氧化酶标记的二抗(1∶1000)，室温孵育1h，PBS漂洗5min×3，封片，在荧光显微镜下观察，摄片。细胞呈绿色者为阳性细胞，应用JEOR801D形态学图像分析系统软件，每片随机取4个视野，记录阳性细胞数，与正常无LPS或药物对照组阳性细胞数相比较，计算细胞活性，细胞活性=实验组4个视野平均细胞数/对照组4个视野平均细胞数×100%。
1.2.3药物处理将细胞接种于6孔板，分为两个大组，分别为姜黄素组和姜黄素衍生物组。在每一组中，又分为8个小组，分别为无药物/无LPS、无药物/有LPS及不同浓度的药物(包括0.5、1、5、10、25，50μg·mL-1)和LPS组(浓度为1μg·mL-1，用药物预处理细胞1h后加入LPS，孵育18h)。每个点做6个平行，其中3个将做免疫组化分析。重复试验3次。
1.2.4Westernblot细胞以1×106/孔接种于6孔板，药物处理18h后，用Westernblot分析细胞裂解上清液中目标蛋白的表达。裂解细胞，收集上清液用BCA法蛋白定量，取等量蛋白，10%SDSPAGE分离后将蛋白转至Nitrocellular膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭膜2h，抗iNOS(1∶500)抗体4℃孵育过夜，TBST充分洗涤膜后用二抗(羊抗鼠IgG/HRP，1∶1000)室温孵育1h，ECL试剂显色成像。以GAPDH作为内参照，即实验组条带强度/对应的GAPDH条带强度。
1.2.5细胞培养液中NO的测定应用Cayman'sNitrate/NitriteColorimetricAssayKit，按照试剂盒的操作步骤，最后在酶标仪上540nm处测定各孔光密度值(OD)，以LPS组的OD值为对照，计算加药组占它的百分比，即实验组OD值/LPS对照组OD值。
1.3统计学方法实验数据以均数±标准差(±s)表示。各实验组间比较用单因素方差分析(onewayANOVA)，P
2结果
2.1免疫组化方法检测细胞活性发现姜黄素及其衍生物浓度在1μg·mL-1时对细胞活性无明显影响;LPS(1μg·mL-1L)单独作用或与姜黄素(1μg·mL-1)、衍生物(10μg·mL-1)共同作用细胞18h，对其活性亦无明显影响;但当姜黄素浓度上升到5μg·mL-1、衍生物浓度上升到25μg·mL-1，与LPS共同作用时，细胞活性分别下降了64.49%和44.65%(P
2.2姜黄素及其衍生物对iNOS表达的抑制作用
在正常条件下，小胶质细胞表达微量iNOS，LPS作用18h后，iNOS蛋白的水平明显增高，与正常对照组(第一条lane)相比较，差异有统计学意义(P
2.3姜黄素及其衍生物对NO生成的抑制作用
1μg·mL-1LPS作用细胞18h后，细胞培养液中的NO含量增加了70%，P
3讨论
大量研究发现，小胶质细胞的激活在很多神经退行性疾病如早老性痴呆、帕金森病等中起着非常重要的作用[5-6]。而小胶质细胞激活后所增量表达的iNOS引起的NO的大量释放，则是介导神经元损伤的一个非常重要的因子。NO作为氧自由基的一种，可刺激细胞，产生兴奋性的谷氨酸，直接损害神经元和少突胶质细胞[7-9];高浓度的NO还可透过细胞膜、线粒体膜，抑制线粒体呼吸链各种复合体的活力;NO与超氧阴离子(O-2)发生快速反应，生成强氧化性的过氧化亚硝基(peroxynitrite，ONOO-)，而引起蛋白质、类脂质及DNA氧化，或分解转化为OH-自由基，对细胞造成不可逆的氧化损伤[10-11]。
姜黄素被证实具有抗氧化、清除自由基、抑制肿瘤生长等方面的作用，在临床上有着很好的应用前景。尽管姜黄素的临床作用为人们普遍看好，但是其存在溶解性差、易被氧化、吸收率低等缺点。因此，目前以姜黄素为先导化合物合成结构更稳定、溶解性更好、活性更高的姜黄素衍生物已成为国际新药开发领域的一个研究热点。姜黄素衍生物可由黄素分子除去两端含芳环取代基团外为1，6-庚二烯-3，5-二酮结构，此中间结构可视为姜黄素分子的B区，即含有烯键、双羰基和活泼亚甲基等，利用B区各部位官能团的特点，分别改变其结构类型而合成。本实验中所用的便是其中的一个衍生物。本文通过对比观察姜黄素及其衍生物对LPS激活的小胶质细胞NO的释放及iNOS的表达，来检测姜黄素及其衍生物的抗氧化活性。
本次实验结果表明，姜黄素及其衍生物都能抑制LPS激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达以及NO的释放，虽然衍生物的活性相对姜黄素来说较弱，提示姜黄素及其衍生物都具有一定的抗炎、抗氧化作用，对于中枢神经系统慢性退行性疾病的预防及治疗有着良好应用前景。
参考文献
[1]张磊，李杰，陈国良.姜黄素衍生物生物活性的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2008，25(4)：55.
[2]AktanF.INOSmediatednitricoxideproductionanditsregulation[J].LifeSciences，2004，75：639-653.
[3]沈勤，施建华，顾建兰，等.炎症胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶基因转录的机制[J].中国临床康复，2006，10(30)：101-104.
[4]LiuB，GaoHM，Wang，JY，etal.Roleofnitricoxideininflammationmediatedneurodegeneration[J].AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences，2002，962：318-331.
[5]WongA，LuthHJ，DeutherConradW，eta1.AdvancedglycationendproductscolocalizewithinduciblenitricoxidesynthaseinAlzheimer′sdisease[J].BrainRes，2001，920(1-2)：32-40.
[6]MurphyA，SunoharaJR，SundaramM.InductionofproteinkinaseCsubstrates，MyristoylatedalaninerichCkinasesubstrate(MARCKS)andMARCKSrelatedprotein(MRP)，byamyloidβproteininmouseBV2microglialcells[J].NeurosciLett，2003，347(1)：9-12.
[7]WongA，LuthHJ，DeutherConradW，eta1.AdvancedglycationendproductscolocalizewithinduciblenitricoxidesynthaseinAlzheimer′sdisease[J].BrainRes，2001，920(1-2)：32-40.
[8]GoldeS，ChandranS，BrownGC，eta1.DifferentpathwaysforiNOSmediatedtoxicityinvitrodependentonneuronalmaturationandNMDAreceptorexpression[J].JNeurochem，2002，82(2)：269-282.
[9]MerrillJE，IgnarroLJ，ShermanMP，eta1.Microglialcellcytotoxicityofoligodendrocytesismediatedthroughnitricoxide[J].JImmunol，1993，151(4)：2132-2141.
【摘要】目的:研究γ射线与LPS协同激活小鼠巨噬细胞RAW264.7的效应机制，以及γ射线与LPS诱导钙结合蛋白S100A8的表达及意义。方法:相差显微镜观察细胞形态;流式细胞计数方法检测细胞周期及活性氧介质（ROI）水平;Griess颜色反应测定细胞NO水平;实时定量RTPCR方法检测细胞S100A8mRNA水平的表达。结果:γ射线与LPS作用于RAW264.7细胞引起细胞形态改变，部分细胞出现非整倍性，少量细胞出现凋亡，胞内ROI水平、NO水平明显升高，S100A8分子mRNA水平明显升高，而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。结论:γ射线与LPS协同诱导巨噬细胞激活是细胞周期改变、信使分子水平变化、炎症因子如S100A8的表达等多方面生物效应的综合结果，其中S100A8基因的表达与巨噬细胞功能状态密切相关。
【关键词】巨噬细胞;γ射线;LPS;S100A8
巨噬细胞在整个免疫反应中起极为重要的作用，辐射后许多组织和器官损伤都涉及到巨噬细胞的功能异常，巨噬细胞的辐射效应一直受到重视。巨噬细胞通常具有辐射抗性，但已有多篇报道证明电离辐射能够促进或直接激活巨噬细胞。一氧化氮（nitricoxide，NO）的生成是巨噬细胞被激活的重要标志，单纯的射线不能引起小鼠巨噬细胞J774.1和RAW264.7细胞中NO水平的改变，但0.5～10Gy射线预处理能够触发这些巨噬细胞为干扰素γ（interferonγ，IFNγ）和（或）脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导生成NO，而且呈现剂量效应关系［1］。
钙结合蛋白S100A8是S100蛋白家族成员，是一个多功能分子，其最主要的功能是参与免疫炎症反应过程［2］。Stassen等［3］研究发现，6GyX射线照射MCF7细胞后48～72h，S100A8被诱导表达，其mRNA水平呈现辐射剂量效应关系。静息态的巨噬细胞不表达S100A8，激活状态的巨噬细胞才表达S100A8分子，S100A8在巨噬细胞中为LPS等炎症因子诱导表达［4］。既然S100A8能够为电离辐射及LPS诱导表达，那么我们需要进一步研究在巨噬细胞中，电离辐射是否与LPS协同诱导S100A8以及S100A8的表达与巨噬细胞功能状态之间的关系。本研究观察比较了RAW264.7细胞受10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h与正常对照、相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态、周期、活性氧介质（reactiveoxygenintermediates，ROI）水平、NO水平及S100A8mRNA等指标的改变并探讨相互之间的关系。
1材料和方法
1.1材料试剂LPS、2’7’二氯荧光素双醋酸盐(2，7dichlorofluorescindictate，DCFHDA)、碘化丙啶(propidiumiodide，PI)为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基干粉、胎牛血清、TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品。随机引物、MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品。BioEasySYBRGreenIRealTimePCRKit为杭州博日公司产品。FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品。Linegene荧光定量PCR检测系统为杭州博日公司产品。
1.2方法
1.2.1RAW264.7细胞培养及处理小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃、50mL/LCO2饱和度条件下培养。对数增殖期细胞照射前24h，换新鲜培养基，不辐射或10Gy60Coγ射线照射，照射后24h，不加或加入5mg/LLPS，继续培养24h。相差显微镜观察细胞形态变化。
1.2.2流式细胞术测定细胞周期乙醇固定骨髓单细胞悬液，PI染色，流式细胞仪检测，具体按文献［5］进行。
1.2.3流式细胞术测定ROI水平约1×106RAW264.7细胞铺种于6孔板中，培养过夜，γ射线或(和)LPS处理后不同时间收集细胞，用无血清RPMI1640培养液洗2遍细胞后，20μmol/LDCFHDA悬浮细胞，37℃孵育30min，无血清RPMI1640培养液洗涤1遍后，0.5mL无血清RPMI1640培养液悬浮细胞，流式细胞仪检测。
1.2.4NO水平检测通过Griess颜色反应测定细胞培养上清中NO-2水平，NO-2水平以吸光值A550表示，具体方法参照文献［1］进行。
1.2.5实时定量RTPCR检测S100A8表达用TRIzol试剂提取RAW264.7细胞总RNA，经紫外分光仪检测A260和A280，测定浓度和纯度。取总RNA2μg，随机引物0.5μg，MMLV逆转录酶200U，进行25μL体系反转录。每PCR反应取2μL反转录产物为模版，加入BioEasySYBRGreenIRealTimePCRKit试剂，于荧光定量PCR检测系统进行实时定量PCR扩增测定CT（Treshholdcycle）值。小鼠S100A8上游引物5′ATCACCATGCCCTCTACAAGA3′，下游引物5′TGCTACTCCTTGTGGCTGTCT3′。看家基因3磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH）上游引物5′CCATGGAGAAGGCCGGGG3′，下游引物5′CAAAGTTGTCATGGATGACC3′。用比较CT方法，以看家基因GAPDH为内参，以未处理正常细胞中S100A8mRNA水平为1，相对定量γ射线或(和)LPS处理后S100A8mRNA的表达水平。相对表达倍数=2^(-CT)，其中CT=γ射线或(和)LPS处理样品的CT-正常对照的CT，CT=S100A8的CT-GAPDH的CT。
1.2.6统计学分析所有数据均以x±s表示，应用SAS9.13统计软件进行两因素析因设计资料的方差分析。
2结果
2.1RAW264.7细胞形态学改变观察比较RAW264.7细胞受10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h与正常对照、相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态学变化，可见正常RAW264.7细胞为圆形，贴壁生长;单纯γ射线或单纯LPS处理的细胞变大，部分细胞伸出伪足、呈梭形，胞内颗粒增多，两种处理细胞形态学改变类似;γ射线与LPS共同作用的细胞变得更大，胞内大量颗粒物，巨噬细胞呈现被激活状态。
2.2RAW264.7细胞倍性、凋亡的改变正常未处理的RAW264.7细胞中非整倍性（aneuploid）细胞、凋亡细胞百分数均为0%;10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h及相应单纯γ射线或单纯LPS处理条件下，细胞均出现部分非整倍性细胞;而只在γ射线与LPS共同作用条件下，细胞才出现明显凋亡（图1）。
2.3RAW264.7细胞胞内ROI水平的改变观察10Gyγ射线照射后0～24h胞内ROI水平的动态变化，照后即刻开始升高，6h达高峰，24h基本恢复到正常水平（图2），可见胞内ROI早期生成明显，随后下降，因此我们比较细胞受各种处理后6h，胞内ROI水平的改变。单纯10Gyγ射线照射后30h（即10Gyγ射线照射后24h，0mg/LLPS继续处理6h），胞内ROI水平不变;单纯5mg/LLPS处理后6h（即0Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理6h），胞内ROI水平升高;10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理6h，胞内ROI水平明显升高，从测定数值看，明显高于单纯5mg/LLPS处理后6h或单纯10Gyγ射线照射后胞内ROI的水平（图3，图2）。图210Gyγ射线照射后0～24h胞内ROI水平的变化
2.4RAW264.7细胞NO水平的变化单纯γ射线照射，胞内NO水平不变;单纯LPS处理条件下，与正常对照相比，胞内NO水平升高;10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h，胞内NO水平明显升高，而且高于单纯LPS处理组，表明γ射线能够促进LPS增强巨噬细胞RAW264.7中NO水平（图4）。
2.5RAW264.7细胞中S100A8分子mRNA表达水平的改变实时定量RTPCR方法检测胞内S100A8mRNA水平的变化。以未处理正常细胞中S100A8mRNA水平为1，单纯10Gyγ射线处理条件下，胞内S100A8mRNA水平为9.0±2.3;单纯5mg/LLPS处理条件下，胞内S100A8mRNA水平为86.0±8.3;10Gyγ射线与5mg/LLPS共同作用条件下，胞内S100A8mRNA水平为630.0±70.8。可见，γ射线、LPS均可诱导巨噬细胞RAW264.7中S100A8mRNA表达，LPS的作用强于γ射线，而且γ射线与LPS具有协同作用。
3讨论
我们的研究表明，RAW264.7细胞受10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h条件下，γ射线与LPS共同作用影响细胞多方面的生物学效应，具体表现为细胞体积明显变大，胞内大量颗粒物，呈现被激活状态;部分细胞呈现非整倍性，少量细胞出现凋亡;胞内ROI水平、NO水平明显升高;S100A8分子mRNA水平明显升高，而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。
γ射线与LPS共同作用使RAW264.7细胞形态改变，胞内大量颗粒物的出现可能反应了细胞酶活性的改变。我们检测了RAW264.7细胞受0～40Gyγ射线照射后0～72h细胞倍性、周期、凋亡的改变，发现随时间、剂量不同，细胞周期呈动态改变，但细胞几乎不出现凋亡，只在γ射线与LPS共同作用条件下细胞才出现凋亡，一定程度说明细胞具有辐射抗性;部分细胞呈现非整倍性，而且这部分细胞DNA含量为正常未处理细胞的两倍，非整倍性的出现可能与细胞分裂受到抑制、细胞功能的改变或细胞分化状态相关。
ROI和DNA损伤是辐射信号转导中的主要信使分子。我们观察到0～40Gy射线照射后6h，RAW264.7细胞胞内ROI水平随照射剂量增加呈现增强趋势，LPS能引起胞内ROI水平升高，而且射线的预处理大大增强了LPS引起细胞ROI水平升高的效应。已有的研究表明，0～10Gyγ射线照射后24h，RAW264.7细胞的DNA损伤随受照剂量增加而增强［6］。在射线促进IFNγ引起J774.1细胞中NO生成的过程中，第二信使是DNA损伤而非ROI［1］。
S100A8能够为辐射诱导表达，紫外线诱导小鼠表皮角化细胞中S100A8的表达，ROI参与了此过程［7］。此外，大鼠肝部受20Gy射线照射后6hS100A8蛋白水平升高，而且该分子的诱导表达可能与受辐射后肝部ROI水平升高有关［8］。我们的研究发现，单纯γ射线或单纯LPS处理条件下，RAW264.7细胞中S100A8mRNA水平升高，而且γ射线与LPS具有协同作用。我们还检测了通常与S100A8形成复合物行使生物学功能的S100A9分子mRNA的表达，未能检测到各种处理条件下该分子的表达及变化，这与已有报道的研究结果一致［3，4，7，8］，说明S100A8本身具有功能特异性。我们的预实验表明，ROI及转录因子激活蛋白1(activatorprotein1，AP1)可能参与了辐射诱导RAW264.7细胞中S100A8表达的过程。S100A8与炎症反应密切相关，那么S100A8诱导表达可能与RAW264.7细胞活性增强有关。此外，S100A8/A9复合物及S100A8、S100A9具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的功能［9］，γ射线与LPS能够增强RAW264.7细胞中S100A8表达、引起该细胞凋亡，两者之间是否存在某种关联还需要进一步的实验验证。
参考文献
［1］IbukiY，MizunoS，GotoR.γIrradiationinducedDNAdamageenhancesNOproductionviaNFkappaBactivationinRAW264.7cells［J］.BiochimBiophysActa，2003，1593(2-3):159-167.
［2］GebhardtC，NémethJ，AngelP，etal.S100A8andS100A9ininflammationandcancer［J］.BiochemPharmacol，2006，72(11):1622-1631.
［3］StassenT，PortM，NuykenI，etal.RadiationinducedgeneexpressioninMCF7cells［J］.IntJRadiatBiol，2003，79(5):319-331.
［4］HsuK，PasseyRJ，EndohY，etal.RegulationofS100A8byglucocorticoids［J］.JImmunol，2005，174(4):2318-2326.
［5］董波，陈肖华，张浩，等.一种改进的用于测定细胞周期的细胞制备方法［J］.军事医学科学院院刊，2002，26(2):124-129.
［6］TokuzumiS，HoriM，MonobeM，etal.EffectofnitricoxideonγrayinducedmicronucleusfrequencyinRAW264.7cells［J］.RadiaRes，2005，164(6):723-732.
［7］GrimbaldestonMA，GeczyCL，TedlaN，etal.S100A8inductioninkeratinocytesbyultravioletAirradiationisdependentonreactiveoxygenintermediates［J］.JInvestDermatol，2003，121(5):1168-1174.
上一篇：蒲松龄《狼》教学设计(整理8篇)
下一篇：敬老院社会实践活动心得(16篇)
热门推荐