细胞的生物学特性(6篇)
时间：2024-07-03
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脐带血是指胎儿娩出，脐带结扎，残留在脐带和胎盘靠近胎儿段内的血液。脐带血中含有两种干细胞：造血干细胞（Hematopoieticstemcells，HSCs）和间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）。脐带血造血干细胞异体移植后发生免疫排斥反应的可能性极低[1]，它已应用于临床治疗，主要用于治疗造血系统疾病（白血病、恶性淋巴瘤、骨髓瘤）、糖尿病、肝脏疾病等。间充质干细胞具有高度的自我更新和多向分化的潜能，这些特性近年来引起了国内外众多研究者的广泛关注。Lee等[2]将冷藏0.1～5年的脐血单个核细胞培养3～5周，获得贴壁的细胞呈现成纤维细胞样形态，并具有间充质细胞的免疫表型，表明可以长期冻存保存脐血间充质干细胞。2000年，Erices[3]首次报道脐血中含有间充质干细胞，其形态和免疫学表型和骨髓间充质干细胞相似。Karen[4]认为脐血间充质干细胞分离成功的关键在于：①从脐血中采集分离时间不超过15h；②脐血的量不少于33ml；③单个核细胞量不少于1×108个。但脐血间充质干细胞分离成功率低[5-6]，甚至有些学者认为脐血中没有间充质干细胞[7-9]。且随着胎龄的增加，脐血间充质干细胞的数量、生长活性及分离培养的成功率逐渐下降。
1影响脐血间充质干细胞分离培养成功的因素
1.1脐血的采集量：个体差异较大，与产妇分娩的方式、采集者操作水平等因素有关，脐血采集量越大、分离的成功率越高。
1.2采集到分离的时间：要求24h内完成分离接种，时间越短分离培养的成功率越高。
1.3分离方法及培养条件的优化：目前脐血间充质干细胞的分离，完全套用骨髓间充质干细胞的分离方法，这可能是导致脐血间充质干细胞分离成功率低的重要原因之一。国内外众多学者对脐血间充质干细胞培养条件进行优化，但由于条件的限制，尚无统一的评价标准，难以进行比较。
1.4首次接种密度：接种密度过大，细胞接触抑制，生存空间不足，培养基中的营养成分消耗过快；密度过低无法形成细胞生长所需的环境或者原代细胞发生老化。
1.5血清浓度：文献报道血清浓度10%～20%，一般认为低浓度血清更利于脐血间充质干细胞生长，高浓度的血清含有大量促进细胞增殖的因子，细胞增殖迅速，容易过早发生老化。胎牛血清中异种蛋白随脐血间充质干细胞移植入人体后会增加细胞毒性反应或者免疫排斥反应的风险。国内有报道，通过从脐血中分离自体血清成功培养出脐血间充质干细胞，可以大大降低免疫反应；但自体血清量少，则难以支持脐血间充质干细胞长期大量扩增。
1.6细胞因子的使用：可以向纯化后的脐血间充质干细胞中添加bFGF、EGF、GM-CSF、IL-3等细胞因子[10]。
1.7pH值：偏酸性的环境抑制造血干细胞及破骨样细胞的生长，有利于脐血间充质干细胞的纯化。
2脐血间充质干细胞的分离方法
2.1密度梯度离心法：为提高单个核细胞分离的成功率，目前多采用自然沉降与密度梯度离心相结合的方法。加速红细胞沉降，可以向脐血中加入大分子物质，如：明胶[12]、羟乙基淀粉、甲基纤维素等，也可以通过红细胞裂解液氯化铵去除红细胞。干细胞的密度与单个核细胞密度基本相同，在高速离心条件下通过分层液Ficoll或Percoll将单个核细胞从脐血中分离出来。该方法操作简单，获得的MSCs量可以满足体外培养所需细胞密度要求。
2.2贴壁培养法：体外培养的脐血间充质干细胞有贴壁生长的特性，但该方法提取的细胞纯度不足，可有大量红细胞、巨噬细胞、破骨样细胞等细胞成分。多次传代后仍可见杂质细胞，对间充质干细胞增殖有一定影响。目前多主张将密度梯度离心与贴壁培养方法相结合，可获得较理想的分离效果。
2.3免疫磁珠分选：表面包被抗体的磁珠与表面标志抗原特异性结合，通过正选或负选将脐血间充质干细胞分离出来。该方法对细胞活性影响较大。
2.4流式细胞仪分选：将干细胞大小和表面标记进行分离，获得的细胞纯度高。免疫磁珠和流式细胞仪分选的方法，对脐血量要求大、抗体价格昂贵，对脐血间充质干细胞的活性影响较大，不适合实验室推广。
2.5单细胞克隆方法：该方法技术要求较高，难以获得大量的脐血间充质干细胞。
3脐血间充质干细胞的培养
脐血间充质干细胞适合在偏酸性的环境中生长，目前常用的培养基有DMEM/F12、LG-DMEM、α-MEM、IMDM培养基。一般认为间充质干细胞专用MesencultTM培养基培养功率较高，但该培养基价格昂贵限制其广泛地使用。如：Both等[13]用α-MEM培养基、低密度接种培养MSCs优于高密度下DMEM培养基培养，添加地塞米松能促进细胞生长；Yang等[14]采用含10%胎牛血清的α-MEM培养基仅有23%的标本成功培养出MSCs；Liu等[15]以l×l07cells/cm2接种密度于含有20%FBS的IMDM培养基中，结果144份脐带血中有108份通过原代培养成功地培养出间充质干细胞，占总数的75%。加入人碱性成纤维细胞生长因子bFGF、人表皮生长因子EGF、粒-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、IL-3等细胞因子[16]对UCB-MSC的生长起促进作用。优化培养可以使原代培养的成功率达到90%以上。目前认为细胞因子作为蛋白质大分子物质，通过结合与作用于受体的胞外域来激活细胞表面受体，并能够识别与结合化学信号，触发靶细胞产生特异的生理效应。但这些细胞因子通过何种途径进行细胞间的信号转导，其机制尚还没有突破性研究。
4脐血间充质干细胞的鉴定
4.1形态学观察：原代脐血间充质干细胞初贴壁时呈圆形或椭圆形，散在分布，双侧伸出突起。折光性较强，突起伸长后呈现单个核的梭形。5～7天可见多个细胞相互聚集形成集落，原代细胞表现为异质性可见梭形、多角形、不规则形状。镜下可以观察到体积较大，多个核的破骨样细胞，体积较小呈圆形的细胞，多个突起的、不规则形态的树突状细胞。3～4周后细胞生长至80%～90%融合时按1：3进行消化传代。传代后的脐血间充质干细胞4～6h开始贴壁，增殖迅速，1周左右可达到80%～90%融合。三代以后细胞形态均匀，梭形的细胞呈漩涡状或者火焰状生长。
4.2免疫表型的鉴定：目前认为MSCs表面抗原无特异性，既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。迟作华[17]总结了脐血间充质干细胞表达的主要分子包括：①粘附分子：CD54、CD51、CD44、CD13等；②整合素家族成员：CD49b、CD49e、CD29等；③其他：CD90（Thy1）、SH2（CD105）、HLA-ABG、ASMA、SH13（CD166，ALCAM）、SH4（CD73）等。但不表达造血细胞表面标志，如：CD45、CD34、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD38、CD133、CD135（FH-3）、CD117（e-kit）、glycophorinA等也不表达与人白细胞抗原（HLA）识别有关的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物Ⅱ类分子，如HLA-DR等。
5面临问题
脐血间充质干细胞分离成功率低，培养周期长，难以建立稳定纯化的细胞系从而实现体外的大量扩增[18]；个体差异较大，尚无统一的体外分离培养标准；缺乏特异的鉴定标记，目前主要通过细胞的形态和非特异表型进行鉴定；定向诱导分化的方法和机制，以及分化后功能能否发挥及如何保持有待深入研究；细胞因子对细胞增殖分化的作用及相互之间存在的影响；确定HLA配型不符的最低标准，以扩大供体的来源；移植治疗的最佳时机、剂量。相信随着对脐血间充质干细胞研究的深入，这些问题终将解决，使脐血间充质干细胞更广泛地应用于基础研究和临床治疗。
[参考文献]
[1]ZeccaM，PreteA，RondelliR，etal.Chronicgraft-versus-hostdiseaseinchildren：incidence，riskfactors，andimpactonoutcome[J].Blood，2002，100（4）：1192-1200.
[2]LeeMW，ChoiJ，YangMS，etal.Mesenchymalstemcellsfromcryopreservedhumanumbilicalcordblood[J].BiochemBiophysResCommun，2004，320（1）：273-278.
[3]EricesA，CongetP，MinguellJJ.Mesenchymalprogenitorcellsinhumanumbilicalcordblood[J].BrJHaematol，2000，109（1）：235-242.
[4]BiebackK，KernS，KluterH，etal.Criticalparametersfortheisolationofmesenchymalstemcellsfromumbilicalcordblood[J].StemCells，2004，22（4）：625-634.
[5]RosadaC，JustesenJ，MelsvikD，etal.TheHumanUmbilicalCordBlood：APotentialSourceforOsteoblastProgenitorCells[J].CalcifiedTissueInternational，2003，72（2）：135-142.
[6]KimJW，KimSY，ParkSY，etal.Mesenchymalprogenitorcellsinthehumanumbilicalcord[J].AnnalsofHematology，2004，83（12）：733-738.
[7]MareschiK，BiasinE，PiacibelloW，etal.Isolationofhumanmesenchymalstemcell：bonemarrowversusumbilicalcordblood[J].Haematologica，2001，86（10）：1099-1100.
[8]WexlerSA，DonaidsonC，Denning-KendallP，etal.Adultbonemarrowisrichsourceofhumanmesenchymal'stem'cellsbutumbilimalcordandmobilizedbloodarenot[J].BrJHaematol，2003，121（2）：368-374.
[9]YuM，XiaoZ，ShenL，etal.Mid-trimesterfeta；blood-derivedadherentcellssharecharacteristicssimilartomesenchymalstemcellsbutfull-termumbilicalcordblooddoesnot[J].BrJHaematol，2004，124（5）：666-675.
[10]JangYK，JungDH，JungMH，etal.Mesenchymalstemcellsfeederlayerfromhumanumbilicalcordbloodforexvivoexpandedgrowthandproliferationofhematopoieticprogenitorcells[J].AnnHematol，2006，85（5）：343-344.
[11]TondreauT，MeulemanN，DelforgeA，etal.MesenchymalstemcellsderivedfromCD133-positivecellsinmobilizedperipheralbloodandcordblood：proliferation，OCT4expression，andplasticity[J].StemCells，2005，23（8）：1105-1112.
[12]姚天华，汤晓雨，杨壮群，等.体外诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化的初步研究[J].中国美容医学，2007，16（4）：450-454.
[13]BothSK，VanD，MuijsenbergAJ，etalArapidandefficientmethodforexpansionofhumanmesenchymalstemcells[J].IssueEng，2007，13（1）：3-9.
[14]YangSE，HaCW，JungM，etal.Mesenchymalstem/progenitorcellsdevelopedinculturesfromUCblood[J].Cytotherapy，2004，6（5）：476-486.
[15]LiuCH，WuML，HwangSM.Optimizationofserumfreemediumforcordbloodmesenchymalstemcells[J].BiochemicalEngineeringJournal，2007，33（1）：1-9.
[16]张积华，孙康，王妍，等.影响脐血间充质干细胞分离培养的关键环节（英文）[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（14）：2653-2656.
[17]迟作华，张洹.脐带血间充质干细胞的研究进展[J].国际生物医学工程杂志，2006，29（1）：29-34.
论文摘要:细胞凋亡又叫细胞程序性死亡，是植物正常发育中必不可少的一部分,目前已成为植物细胞生物学研究的一个热点。本文对植物凋亡的一般特征、植物营养和生殖生长中的细胞凋亡以及植物-病原物互作中的细胞凋亡进行了综合评述,并对植物细胞凋亡研究的现实意义进行了探讨。
细胞凋亡是多细胞生物体在生理或病理条件下部分细胞所采取的一种由内在基因编程调节,通过主动的生化过程而自杀死亡的方式[1]。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以常常又称为细胞编程性死亡。细胞凋亡的现象最早是Kree在1965年观察到的，经过进一步深入研究之后，他于1972年将其重新命名为细胞凋亡。之后近20年，细胞凋亡的研究主要集中在动物，人们越来越认识到细胞调亡在动物生长发育中、尤其在维持动物体内细胞和组织平衡、特化、形态建成和防病、抗病过程中的重要作用。同动物一样，在植物生长发育中也存在着细胞凋亡现象。但由于植物生长发育和细胞结构的特殊性，有关植物细胞凋亡的研究起步较晚。近年来，随着植物细胞凋亡的研究进展，人们逐渐认识到细胞凋亡是高等植物生长发育的必要组成部分，同时也是植物体度过不良环境的重要手段。目前,植物细胞凋亡的研究已成为近年来植物细胞生物学的新兴研究领域和热点之一。本文就植物细胞凋亡的一般特征、检测方法、在植物中的存在及意义作一综合阐述。
1植物细胞凋亡的一般特征
经历细胞凋亡过程的细胞呈现一些典型的形态学变化,光学显微镜或电子显微镜观察可见:细胞体积缩小,染色质凝集、断裂、趋边化,细胞器解体、消失,细胞膜发泡形成凋亡小体(其中包含有凝集的细胞核断片和细胞器)[3.4]。随着研究的深入,分子生物学证据也逐步被阐明:细胞染色质DNA在核小体连接部位断裂,其片段大小为200bp的倍数,经琼脂糖凝胶电泳可见到特征性的DNA梯度(DNAladder),此特征还可以通过超速离心、末端标记电泳以及原位缺口翻译技术等进行定性、定量测定。细胞形态学和分子生物学的变化是细胞凋亡的重要诊断依据。
2细胞凋亡的检测方法
2.1细胞形态学观察法
苏木素-伊红(HE)染色法:石蜡切片的HE染色是组织形态学检测的常规方法,光学显微镜下细胞核呈蓝黑色,胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布,表现在核染色质致密浓缩,核碎裂等。
(1)电子显微镜。电镜观察,凋亡细胞染色质固缩,常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体,初期细胞可见完整的细胞器,细胞膜完整,凋亡小体形成。目前一致认为,电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞凋亡的最可靠依据。
(2)荧光显微镜。对体外培养的活细胞经荧光色素处理,可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有吖啶橙、Hoechst33258或Hoechst33342、碘化丙啶(PI)、溴乙锭(EB)。前两种可分别进入活细胞和死细胞,而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光,正常细胞呈均匀荧光染色,而凋亡细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。
2.2反映凋亡细胞膜改变的方法：染料排斥法。
除了电镜能反映细胞膜完整性外,还可用染料排斥法,如台盼蓝、PI等。坏死细胞膜破损,被染料着染。而凋亡细胞细胞膜完整,不被着染。但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死。因此,此法不能单独用来判断凋亡细胞。另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上,磷脂酰丝氨酸基团(PS)位于胞内侧,而在细胞凋亡早期膜上此基团则转向胞外侧,以利于被吞噬。因此,磷脂酰丝氨酸基团位置的改变,可作为凋亡细胞的一个标志。
2.3反映脱氧核糖核酸有规律断裂的方法
细胞凋亡过程中,DNA有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。
(1)琼脂糖凝胶电泳法。细胞悬液经裂解消化按常规法提取DNA后,于含EB的琼脂糖凝胶中进行电泳,正常细胞DNA呈单一条带。细胞凋亡时呈典型的梯状条带,系180～200bp左右的及多聚核小体的梯状DNA条带。坏死时则呈现模糊的弥散状条带。DNA电泳法是判断细胞凋亡的经典方法.PEG6000诱导的小麦叶片[7]、羟自由基诱导的烟草细胞[8]、细胞色素c诱导的胡萝卜和烟草原生质体[9]和乙烯诱导的胡萝卜原生质体[10]发生PCD时均检测到DNA梯状条带。
(2)流式细胞仪检测法。细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用萤光素染色利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞萤光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
(3)原位末端标记法(InSituEnd2Labeling,ISEL)。通过DNA多聚酶I把已标记的核苷酸结合到DNA的单链断裂处,以寻找有无Ap发生。标记的方法有同位素标记、荧光素标记、地高辛或生物素标记等。
(4)原位切口平移法(InSituNickTranslation,IS2NT)。利用DNA多聚酶将核苷酸整合到Ap细胞内断裂的DNA3′羟基末端,同时水解5′末端,以修复DNA。若用已标记的核苷酸,即可显示出有断裂DNA的细胞。该法同样也可用于细胞悬液中Ap的观察。
(5)末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT2me2diatedX2dUTPnickendlabeling,TUNEL)。末端转移酶(TdT)介导的X2dUTP缺口标记法是目标原位检测Ap最为敏感、快速、特异的方法,其具有广泛的应用前景。末端转移酶(TdT)可催化在DN段的3′羟基末端合成多核苷酸聚合物的反应,即DN段加尾。利用末端转移酶(TdT)将标记的脱氧核苷酸转移到DNA缺口或3′羟基末端上,通常所用的核苷酸为dUTP,标记物为地戈辛、生物素、荧光素等。
(6)ELISA法。对Ap细胞内DN段的检测还可用ELISA法。悬浮细胞经裂解,高速离心去除核的成分后,取上清加入已包被有抗组蛋白抗体的反应板,反应后再加酶标抗DNA抗体,若上清中含断裂的DN段,则可通过此双抗体夹心法得以检出[11]。
3植物发育过程中的细胞凋亡
萌发的种子中的糊粉层、维管束的木质部、生殖器官的组织(如花药和子房)及根冠等组织中均有细胞凋亡的发生[12]。虽然在细胞水平上,与细胞凋亡相关联的水解酶的激活、一些蛋白的失活以及核DNA的断裂都可以经常观察到,但是这些现象的发生机制到近来才有所了解。
3.1导管的形成
导管是由排列有序的死亡的导管分子(trachearyelements,TEs)构成。王雅清和崔克明[13]对杜仲木质部导管分化的研究证明,其分化过程也发生了细胞凋亡。所有这些研究都表明木质部导管分化与细胞凋亡有密切关系。玉米生长过程中在一定条件下根部皮层细胞崩溃死亡形成通气组织,而通气组织与植物的同化、呼吸、蒸腾作用都有密切关系[14].
3.2单性花的形成
许多单性花植物在花原基分化时存在雌蕊和雄蕊原基细胞,在后期发育的特定阶段雌蕊或雄蕊原基细胞出现细胞凋亡,从而最终形成单性花。
3.3大、小孢子的形成和发育
大多数种子植物中,大孢子母细胞减数分裂形成4个大孢子。仅有1个能发育成雌配子体,其余的3个大孢子退化。例如,蕨类植物大孢子母细胞减数分裂产生4个大孢子,这4个大孢子通常呈线型或T型排列,仅有1个能继续发育成雌配子体,其余3个都死亡。对其超微结构的研究表明,其退化解体过程也符合细胞凋亡的基本特征[15]。
3．3雌雄配子体的发育
植物中雌雄配子体的发育有细胞凋亡参与其中。裸子植物雄配子体发育过程中,原叶细胞的退化和雌配子中颈细胞、腹沟细胞的消失及珠心细胞的衰退也是细胞凋亡的结果。在被子植物雌配子体(胚囊)发育过程中,珠心组织被作为营养物质吸收而退化的过程是细胞凋亡[16].
3．4胚的发育
在胚性细胞分化和发育过程中,存在着细胞凋亡[17]。植物的胚由受精卵发育而成,在胚的形成过程中,助细胞、反足细胞和胚柄细胞都因发生细胞凋亡而消失。胚柄由受精卵第一次分裂形成,当胚发育到一定阶段,胚柄发生细胞凋亡,形态上表现为质壁分离,原生质体固缩。单子叶植物的种子中,在胚和胚乳之间有一层或几层排列整齐的糊粉层细胞,含大量糊粉粒。胚胎发育早期由胚柄提供营养形成种子,后期则通过糊粉层细胞形成分泌组织,分泌水解酶,水解胚乳成分,种子萌发后,糊粉层功能完成,便开始凋亡,是典型的细胞凋亡。在种子萌发过程中,其他胚乳和无胚乳种子子叶中一些贮藏细胞也会发生类似的细胞凋亡,没有这些细胞凋亡,幼苗就不能正常生长发育,会因饥饿而死亡。
3.5根冠细胞的死亡
根冠位于根尖的顶部,是由许多薄壁细胞组成的冠状结构。在根的发育过程中,根冠细胞不断脱落,并由顶端分生组织不断产生新的细胞,从内侧补充使根冠细胞得以保持定数。对根冠细胞脱落的研究证明,其脱落过程是典型的细胞凋亡。正是这些细胞的主动死亡,才保证了根顶端分生组织在生长过程中避免与土壤磨擦而受伤,进而保证了根的正常发育。对玉米根尖进行低温胁迫或用细胞毒素类药物如放线菌D、秋水仙碱处理后,这些根尖分生组织细胞同样具有DNAladder、染色质和细胞核浓缩等特征,说明环境因子和药物也可诱导根尖细胞发生凋亡[19.20]。
3.6叶发育过程中的细胞凋亡
在叶子的发育过程中,叶缘的各种裂、齿和叶片中的空洞(如龟背竹叶片)的形成等都是由于相关部位细胞的凋亡所造成的。此外,对叶片衰老过程的研究发现,衰老起始时,叶绿体首先被自体吞噬,此后水解酶、RNA酶等活性上升,而且以液泡内半胱氨酸蛋白酶活性最为显著[21],这些都是细胞凋亡的特征。因此,叶子脱落前叶片的衰老过程也是PCD。
4环境胁迫诱导的植物PCD
4.1植物超敏反应中的PCD
超敏反应(hypersensitiveresponseHR)是植物被病原物侵染后所引起的适应性反应,其中的细胞死亡被证明是细胞凋亡。在植物超敏反应中,DN段化,特征性切割核小体的核酸酶被激活等生理生化特征和凋亡小体等形态特征都被证实。4.2盐胁迫诱导的PCD
无机盐KCN、NaCl、CaCl2和一些重金属离子等在一定条件下均可诱导植物细胞出现与动物细胞凋亡类似的特征。宁顺斌[22]等人的实验证明烟草、玉米的根尖在高盐(NaCl500mmol/L)处理后,出现明显的DNA梯状电泳图谱。林久生和王根轩[23]用20%PEG溶液(-0.63MPa)对小麦根系进行渗透胁迫，在小麦叶片DNA琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到明显的梯状DNA条带，表明PEG处理诱发了DNA核小体间的断裂，末端脱氧核糖核酸转移酶介导的3’OH末端标记法(TUNEL)检测出现阳性结果。
4.3活性氧与植物细胞凋亡
活性氧是一类具有强氧化能力的物质,主要包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基等,各种逆境条件,包括冷害、渗透胁迫、低氧、臭氧、紫外线等导致的植物细胞凋亡最终都与活性氧的产生有关。当细胞外一些信息如辐射、高温等通过细胞活性氧传入细胞引起其脂质过氧化或与细胞凋亡有关基因的表达时，细胞也会凋亡[24]。陈明等[25]研究发现以一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)处理小麦可以明显提高ROS清除酶，如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等活性，从而清除因盐胁迫产生的氧自由基或活性氧ROS，或直接清除ROS来保持细胞处于还原状态。
5研究植物细胞凋亡的意义及展望
导管细胞的退化死亡、筛管细胞原生质的自溶,形成了植物体的输导组织;这些细胞死亡之前,细胞内物质可被其他细胞回收利用,这是植物能够独立营养的一个特性,叶片衰老死亡即是适应营养重新分配的结果,但这个过程却影响了农产品的产量。因此,要搞清植物细胞凋亡的发生程序,对粮食生产及作物储藏技术改良都具有重要的现实意义。在超敏反应中,被病原体感染的宿主细胞采取主动死亡的方式,从而限制感染部位病原菌的生长,阻止病原菌的传播,以达到防病抗病的目的。这种植物自身的主动抗病反应,若在植物抗病育种中加以应用,使植物能够自动、有效地抵抗病原物的侵染,就可以减少农药的使用,避免环境污染,从而提高人类生活质量。
由于植物细胞凋亡的同步性很低、凋亡时间很短,同时由于细胞内各种因子相互作用,调控机制及其复杂,使分子生物学技术应用于细胞水平的研究存在很大困难。近年来,利用非细胞体系来研究细胞凋亡的模式的建立和应用弥补了上述不足。有研究表明[26],利用非细胞体系研究细胞内复杂的生化活动具有独特的优越性,在细胞周期调控、DNA复制、核小体与染色质构建等研究中发挥了重要作用。非细胞凋亡体系的建立与利用,在很大程度上促进了人们对植物细胞凋亡生化和分子机制的研究,为植物细胞凋亡研究开辟了新途径。
随着植物细胞凋亡的研究的逐步深入,发现植物细胞凋亡需要研究的方面还很多。植物体发生细胞凋亡的机理还不清楚,植物细胞中与细胞凋亡有关的基因研究还远没有动物深入。尽管许多实验表明植物细胞凋亡与动物是相似的,但分子水平共同特征少,目前仅发现少数几个基因参与植物细胞凋亡的过程[27]。研究过程中常局限于某一特定现象,很少有将这些现象和植物发育的具体过程联系起来,加上植物生长周期较长,给研究带来一定困难。植物细胞凋亡的研究如果能与植物的经济利用联系起来,将具有重要实践价值。如能发现诱导果实发育中细胞凋亡发生的因子,通过人为调控,改变生长发育期,提高果品产量和品质,则将会极大地推动果树现代化生产的发展。
参考文献
[1]张亚历等.编程性细胞死亡及研究方法[J].细胞生物学杂志,17(3):127-128.
[2]蒋争凡,翟中和.细胞凋亡[J].科学通报,1999,44(18):1920-1928.
[3]宝福凯.编程性细胞死亡的研究现状及展望[J].1995年,细胞生物学杂志,17(3):122-126.
[4]杨帆，王文亮，王伯云.细胞与分子免疫学杂志，1997，13（1）：8—9
[7]林久生,王根轩.渗透胁迫诱导的小麦叶片细胞程序性死亡.植物生理学报,2001,27:221～225.
[8]夏慧莉,陈浩4华志明，陈睦传，沈明山.生物工程进展，1998，18（3）：32—36
[9]孙英丽,赵允,刘春香,翟中和.细胞色素c能诱导植物细胞编程性死亡.植物学报,1999,41:379～383.
[10]周军,朱海珍,姜晓芳,戴尧仁.乙烯诱导胡萝卜原生质体凋亡.植物学报,1999,41:747～750.
[11]张伟成,严文梅,娄成后.小麦衰退珠心中解体原生质体向胚囊的迁移及其对增殖中反足细胞的哺育[J].植物学报,1984,26(1):11221.
[12]郭小丁.植物细胞的编程性死亡[J].1998年,植物学通报,15(5):40-43.
[13]王雅清,崔克明.杜仲次生木质部导管分子分化中的程序性死亡[J].植物学报,1998,40:1102-1107.
[14]华志明,陈睦传,沈明山.细胞生存与死亡的社会控制[J].1998年,生物工程进展,18(3):32–36
.[15]陈朱希昭,陈耀堂,高信曾.太谷核不育小麦花药组织和小孢子发生的超微结构研究[J]1植物学报,1984,26:235–240
[16]尤瑞麟.小麦珠心细胞衰退过程的超微结构研究[J].植物学报,1985,27:345-353.
[17]邢更妹,李杉.植物体细胞胚发生中抗氧化系统代谢动态和细胞程序性死亡[J].生命科学,2000,12(5):214-216..
[19]宁顺斌,宋运淳,王玲,等.低温胁迫诱导玉米根尖细胞凋亡的形态和生化证据[J].植物生理学报,2000,26(3):189-194.
[20]宁顺斌,宋运淳.药物诱导的玉米根尖细胞凋亡[J].植物学报,2000,42(7):693-696.
[21]杨征,蔡陈凌,宋运淳.植物细胞凋亡研究进展[J].生物化学和生物物理进展,1999,26(5):4392443
[22]宁顺斌,宋运淳,王玲等.盐胁迫诱导的植物细胞凋亡———植物抗盐的可能性生理机制[J].实验生物学报,2000,33(3):6132623.
潘建伟,陈虹,顾青(2002)环境胁迫诱导的植物细胞程序性死亡.遗传,24:385-388
[23]林久生,王根轩.渗透胁迫诱导的小麦时片细胞程序性死亡.植物生理学报,2001,27(3):221~225
[24]吴逸,戴尧仁.羟自由基诱导烟草细胞凋亡.植物生理学报,1999,25:339～342.
[25]陈明,沈文飚,阮海华,等.一氧化氮对盐胁迫下小麦幼苗根生长和氧化损伤的影响.植物生理与分子生物学学报,2004,30(5):569~576
AbstractItisquickconvientgood-repeatingandcheapthatexaminingthebioticmaterialscompatibilitythroughcell-culturingmethod,anditismoreandmoreimportantinevaluatingthecompatibilityofbioticmaterial.Thenewmaterialappeatingcontinouslycomplicatingofthepartandaimmaterialbeplantedintheintensityofmaterialstoxiceffectthereactionscomplicationofmaterialandbioticbody,allofthesedecidethevarietyofexperimentmethodandcellsincelltoxicityexperiment.Itisveryimportantthatchoicestherightexperimentmethodandcellsaccordingtothematerialscharacterthepartandaimthematerialbeplantedin.Theevaluationofbioticmaterialscompatibilitystressedonthechangingofcellsformandquantitybefore.Inrecentyears,moreandmorereportsappearaboutmaterialinflueancesthegrowth.adhesionproliferationandmetabolizingofcell.andpresentsthepointthattheevaluationstandardofbioticmaterialscompatibilityshouldbesetaccordingtotheactivecellsquantityandtheirbiningmanysubjectstechnologicaldevelopment,suchasimmunology,chemistry,radiationandshadowgraphy,thoroughlyinquiresthechangeingrelationofcellsstructureandfuntion,furtherlyclarifesthematerialseffectoncell,Itisthedevelopingdirectioninthefuturethatevaluatesthebioticmaterialscompatibilityincedd-culturingmethod.
KeywordsBioticmaterialCell-culturingCompatibilityToxicityexperiment
生物材料的临床应用已有较长的历史，广泛应用于牙科、眼科、整形外科及心血管外科领域。目前美每年有2-3百万人工脏器或假肢植入人体中。生物材料不仅要具有临床使用时所需要的理化性能，还必须具有良好的生物相容性，以保证使用安全。如何快速准确地评价材料的生物相容性，对于研制新材料和缩短研究周期起着重要的作用[1]。
根据1982年美国国家标准学会和牙科协会（ANSI/ADA）公布的评价生物相容性实验标准草案，评价生物相容性的实验方法有全身毒性试验（口服法）、急性全身毒性试验（静脉注射法）、吸入毒性试验、溶血试验、皮下植入试验、骨内植入试验、过敏试验等[2]。细胞培养法作为检测材料毒性的手段（亦称为细胞毒性试验），具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点，正日益受到人们的广泛重视。本文就该研究领域近几年的发展及动向作一简介。
1细胞毒性试验方法的进展
1948年RosenBluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作，迄今为止这方面已有大量的工作积累与研究发现。细胞毒性试验在评价材料生物相容性地位已得到公认[3]。由于目前对生物相容性概念及机理还完全了解，加之材料的多样性、置入要体内环境中的变异性、材料与机体作用的复杂性等因素，故迄今为止，国内外还没有一个统一细胞毒性试验方法。
细胞毒性试验由于细胞培养方式（如单层细胞培养、细胞悬液与材料混合培养、细胞在材料上培养等）的不同，细胞与材料之间有无间质（即细胞直接与材料或其浸出液接触，还是通过间质接触）以及材料毒性成份（即材料本身、浸出物、扩散物或材料降解产物等）不同决定了细胞毒性试验方法的多样性。根据细胞和材料之间有无间质可以将细胞毒性试验方法分为间接法与直接法两大类。
1.1间接法
最典型的间接法是琼脂覆盖法，该法是Dubecco在1952年首先提出[4]。其方法是将含有培养液的琼层平铺在有单层细胞的培养皿中，再在固化的琼脂层上放上试样进行细胞培养。此法优点是不管试验材料是什么形态（膜、粉末或油脂状）等都适用。但该法敏感性受试样溶出物琼脂层上扩散程度的影响。当溶出物分子量小，易溶于水，其毒性发现早且较强。反之即使有毒的材料，如溶出物分子量大并难溶于水，使用该法时材料毒性就难以表现出来。
为克服琼脂法的缺点，SabitaSriva等提出分子滤过法[3]。该法是在单层细胞上覆盖一层丙烯盐制成的微孔滤膜，将试样材料放在滤膜上，使材料毒性在成份通过滤膜作用于其下的细胞。由于滤膜微孔直径约0.45μm,Bondemark认为该法适合评价毒性成份分子量小的材料的相容性[5]。vanLuyn等1992年报道用甲基纤维素细胞培养法评价聚合物的细胞毒性[6]。该法是在甲基纤维素中混入细胞表面进行培养。该法优点是生物材料的水解及细胞坏死释放出的蛋白分解酶引起的酶解作用均要发生，因此可同观察到生物材料的原发性及继发性细胞毒性。
1.2直接法
生物材料中一些易溶出物质引起炎症反应和组织反应的主要原因。易溶出物质一般是原料单体、低分子聚合物、催化剂、溶剂、稳定剂、乳化剂等。为研究这些溶出物的细胞毒性，一些学者提出浸出液法。该法是将试样投入培养液或蒸馏水中适当条件下进行浸泡，制备出含有溶出的浸泡液再将浸了液加在含有细胞的培养皿或试管中继续培养，观察溶出物对细胞的影响。Oshima认为不同浸提条件和浸提方式所制备的材料溶出物在细胞敏感程度上并无显著性差异[7]。
直接浸渍法：该法是形态不规则的试样（如金属粉末、油脂类材料）等与细胞一起放入培养皿中进行培养。当有溶出物时试样周围的细胞就会受到影响。宁淑华等1988年用该法对医用硅胶及聚乙烯醇进行细胞毒性试验[8]。作者认为对于形态不规则有微量毒性的材料使用该法较为适宜。
另一些学者在直接法基础上提出直接接触法。该法将细胞直接放在生物材料上进行细胞培养。当有毒性物质释放时，由细胞形态变化和数量增减检测细胞毒性程度，同时可以直接观察到细胞在材料表面贴附情况。直接接触法不仅能直接检测材料溶出物的细胞毒性，同时也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段。通常“材料生物相容性好”，很多场合都是指细胞容易贴壁且能迅速繁殖生长。因此可根据直接接触法细胞培养的结果推测材料植入人体后与机体细胞的反应。但是，对于与血液接触的循环系统来说，为了避免引起血栓形成，就希望细胞难以贴壁且不易增殖。因此应根据材料的使用目的，作出相应的生物相容性判断。
Tsuchiya[9]等于1994年对琼脂法、分子滤过法、浸出液和直接接触法对材料的细胞毒性敏感程度的差异性进行比较。作者认为浸出液法适合检测材料溶出物毒性，并与动物毒性试验结果相符合。直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高，可测出材料微弱的细胞毒性。琼脂法适合对毒性大的大指材料进行筛选。分子滤过法适合毒性成份分子子量小的材料进行生物相容性评价。
综上所述。细胞毒性试验方法多种多样，并各有其特色。每种试验方法因其原理及方法不同，选择材料的针对性也不同。根据实验材料本身理化性质、毒性成份表现形式、毒性作用强弱及材料用途选择正确的实验方法是至关重要的。
2实验细胞研究进展
目前细胞毒性试验中应用最早的及使用最广泛的细胞是L-929细胞，该细胞是Earle等1948年从小鼠皮小组织中分离出的成纤维细胞。另一种应用较多的细胞是Gey等1953年从人类子宫肿瘤中分离出的子宫粘膜上细胞（HeLa细胞）[10]。由于这两种具有传代容易，繁殖迅速、体外培养条件低、易储存，同时这两种已建立成系的细胞株能为实验提供稳定传代的细胞，能为许多材料细胞毒性评价所共用等优点。1982年美国质量标准协会将L-929细胞和HaLe细胞推荐为细胞毒性试验中的标准细胞[2]。
由于L-929细胞来源于小鼠的皮下组织，HaLe细胞来源于人的肿瘤组织。这两种已建立成系的细胞株都具有无限分裂增殖类似肿瘤细胞的特征。因此人们对利用这现两种细胞代替人体正常组织细胞评价材料的生物相容性的敏感性及可靠性产生了疑问。同时随着不断涌现，人们对材料植入人体后与机体组织之间可能发生的反应其对材料的影响产生了浓厚的兴趣。因此单用L0929和HaLe细胞培养检测材料的生物相容性已不能满足人们的这种需要。
从九十年代起越来越多学者根据材料植入体内的不同部位及使用目的选择人体不部位或/和组织来源的细胞作业实验细胞，使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实，其结果更为准确与客观。
对宿主而言植入宿主体内的生物材料是种异物，因此材料植入体内最普遍和最常见的反应是免疫排斥反应。由于单核巨噬细胞来源于人体的血液，在人体免疫系统中起着重要的作用，能释放各种刺激因子激活补体引起急慢性炎症反应，同时刺激成纤维细胞生长促进伤品的愈合。因此选择单核巨噬细胞作评价材料细胞毒性的实验细胞，有助于人们了解材料置入体内引起的炎症反应对组织细胞的影响[1]。
Cheung认为不同组织来源的细胞材料的敏感性是有差异的[12]。只用软组织来源的细胞培养检测材料的细胞毒性尚不能全面反映出材料的生物相容性。以骨替代材料和牙用材料为例。前者种植到骨组织内，所接触的是骨环境，而后者存在于软组织环境中。因此骨替代材料应选择骨组织来源的细胞，因为这种细胞在体外培养中可形成体内环境一致的矿物化小结，这种小结内含有类成骨细胞和类骨髓细胞及钙化的胶原基质，使体外细胞包培养更好地模拟了生物材料与骨组织在体内的反应。牙用材料可释放一些可溶性的毒性成份如Na+、Ca2+、Al3+和氟化物等[]14，这些可溶物质主要影响邻近的牙组织及口腔粘膜的上皮细胞、成纤维细胞及各种免疫细胞，并对这些细胞的生长、附着增殖及代谢等功能产生影响。因此对牙材料采用口腔粘膜的成纤细胞或/和上皮细胞才能更准确地反映出材料的生物相容性。
3细胞毒性的观察方法
以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量，通过细胞形态的改变和数量的增减判断材料的细胞毒性[15]。由于材料毒性成份对细胞的损伤，首先发生细胞生物化学反应和生物分子结构的改变，出现代谢和机能的改变如线粒体氧化代谢障碍、蛋白质合成下降，细胞膜选择性通透屏障作用消失等，这种变化用形态学方法通常不能发现。只有当细胞死亡10h以上，细胞的自溶性变化相当明显的才能在光显微镜下根据细胞死亡的判断特点，即核浓缩、核碎裂、胞浆伊红染色等判断材料的细胞毒性程度。因此传统的细胞毒性观察方法不能及时、准确地判断材料的细胞毒性。
九十年代以来，越来越多学者倾向于从材料毒性成份引起细胞死亡所产生的细胞形态和数量的变化评价材料生物相容性转移到材料对细胞的生长、附着、增殖及代谢功能的影响，并提出了以存活的有功能的细胞或/和细胞生长增殖情况作材料的生物相容性评价指标。
在体外细胞培养中已有学者提出一些能敏感地反映细胞活力功/和细胞殖的实验室评价方法。如放射性位素（3H-胸腺嘧啶，3H-亮氨酸等）摄入法[16]、荧光染色法（如乙酰乙酸荧光素）[18]、流式细胞光度术等[19]。这此方法各有其优缺点及适用范围。
放射性同位素摄入法是在培养基中掺入3H-胸腺嘧啶或/和3H-亮氨酸等，根据3H-胸腺嘧啶在细胞内含量测量DNA的合成含量，3H-亮氨酸含量测定细胞内蛋白质合成清况[16]。该法能揭示细胞分子水平的动态变化，是研究细胞代谢状态的重要手段。但同位素物质对研究人员会造成一定程度的放射性损害，同时需要特殊设计的实验室和一些特殊设备是其缺点。
四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法（MTT法）是由Mosroann在1983年提出，最初应用于免疫学领域，近年一些学者将该法应用到生物相容性评价中[20]。其原理是线粒体琥珀酸脱氢酶能催化四甲基偶氮唑盐（MTT）形成兰色甲替。形成数目的多寡与活细胞数目和功能状态呈正相关，该法简便迅速、不接触同位素、而敏感性同位素法接近。该法缺点是甲替有时易聚集成团影响结果的难确性。
荧光染色法：其基本原理是当细胞受到损伤时，细胞膜的选择通透性屏障作用消失，利用乙酰乙酸荧光素和溴化乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在荧光显微镜下迅速区分受损细胞[22]该法特点适合评价首先影响细胞膜功能的材料的生理相容性。
流式细胞光度术（Flowcytometry,FCM）是近几年迅速发展起来的分析细胞的方法[22]。该法利用鞘流原理，使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列，按重力方向流动。细胞被激光照射后反射荧光，检测器械可逐个结细胞的荧光强度进行测定。FCM对细胞测定能力30-60万个细胞/分钟，同时可对细胞的核酸，蛋白质、酶、细胞周期分布等八种量进行测定。该法在材料的生物相容性评价中有着广泛的应用价值。
有用的知识才是真正的知识，知识的实用才有价值意义。智商的高低体现知识多少，情商的高低体现能力的大小。下面小编给大家分享一些高中生物会考的知识，希望能够帮助大家，欢迎阅读!
高中生物会考的知识11.细胞内的主要生命物质是?蛋白质和核酸
2.生命活动的直接能源物质ATP、主要能源物质葡萄糖、生物体最好的储能物质脂肪
3.酶的特点是?专一性、高效性激素作用的特点是?特异性、高效性
4.碘是人体合成什么的原料?甲状腺激素钙是人体什么的主要成分?骨骼铁是人体合成什么的重要成分?血红蛋白镁是植物合成什么的重要成分?叶绿素磷是组成细胞什么结构的重要成分?细胞膜
5.鉴定下列有机物的试剂及现象：淀粉、还原性糖、脂肪、蛋白质
淀粉：碘液;变蓝
还原性糖：班氏试剂、加热;红黄色
脂肪：苏丹Ⅲ染液;橘红色
蛋白质：双缩尿试剂(5%的NaOH2~3mL，1%的CuSO42~3滴);紫色
6.植物的多糖、动物的多糖各有什么作用?动物合成糖原储存能量，植物形成淀粉用于储存能量、形成纤维素形成细胞壁
7.动物饥饿或冬眠时，有机物的消耗顺序?糖类、脂肪、蛋白质
8.细胞膜的化学成分是?磷脂、蛋白质、多糖(外有内无)、胆固醇其中骨架是?磷脂双分子层
9.物质通过细胞膜的方式有那几种?协助扩散，自由扩散，主动运输主要方式是哪一种?主动运输
10.原生质层的组成?细胞膜、液泡膜、细胞质
11.三羧酸循环、H与O结合生成水依次在线粒体的哪里进行?线粒体基质/内膜
12.生物学发展进入细胞水平的标志?显微镜的发明进入分子水平的标志?DNA分子双螺旋结构模型
13.蛋白质多样性的原因?氨基酸的种类、数目、排列顺序不同，肽链的空间结构不同
14.氨基酸的通式、肽键的结构
15.细胞膜的结构特点和功能特点?结构：半流动性功能：选择透过性
16.物质出入细胞的方式有哪几种?协助扩散，自由扩散，主动运输，胞吞、胞吐
17.线粒体功能?有氧呼吸的主要场所核糖体功能?蛋白质合成的场所中心体功能?有丝分裂有关内质网功能?蛋白质加工、运输，脂类代谢高尔基体功能?蛋白质的储存、加工和转运
18.原核细胞与真核细胞的差异?有无成形的细胞核
19.病毒的种类?DNA/RNA病毒(动物病毒、植物病毒、细菌病毒)
20.艾滋病毒的传播途径有哪些?血液传播、母婴传播、性传播
高中生物会考的知识21.酶的定义?由活细胞产生的具有催化作用的生物大分子
2.ATP的中文名称、结构简式?腺苷三磷酸A-P~P~P
3.叶绿体层析在滤纸条上的名称和颜色分布?自上而下：胡萝卜素(橙黄色，蓝紫光)叶黄素(黄色，蓝紫光)叶绿素a(蓝绿色，红橙光、蓝紫光)叶绿素b(黄绿色，红橙光、蓝紫光)
4.光合作用的光反应和暗反应的能量变化光：光能-活跃化学能暗：活跃化学能-稳定化学能
5.光合作用的反应式?6CO2+12H2O——>C6H12O6+6H2O+6O2
6.影响光合作用的因素?温度、光照、CO2浓度
7.有氧呼吸的场所?细胞质基质、线粒体
8.无氧呼吸的2个反应式?C6H12O6C2H5OH+CO2+能量、C6H12O62C3H6O3(乳酸)+能量
9.呼吸作用的意义?氧化分解有机物，为生命活动提供能量
10.糖代谢的途径?多糖分为肝糖原与肌糖原，肝糖原能合成葡萄糖
11.噬菌体侵染细菌的过程?吸附注入复制合成释放
12.什么是基因?携带遗传信息，具有遗传效应的DNA片段
13.DNA复制的方式和特点?半保留复制，边复制边解旋
14.DNA复制、转录、翻译的场所?细胞核，细胞核，核糖体
15.基因工程的三种必要工具?
(1)基因的剪刀—限制酶
(2)基因的化学浆糊—DNA连接酶
(3)基因的运输工具—质粒
16.基因工程的三大分支?动物、植物、微生物基因工程
17.基因工程的基本过程?获取目的基因，目的基因与运载体重组，将目的基因导入受体细胞，筛选含目的基因的受体细胞
18.获取目的基因的2种方式?化学方法人工合成，从生物体细胞中分离
19.转基因生物产品的安全性问题主要集中在那两方面?
20.中心法则及其发展
21.常见的无性繁殖方式?孢子生殖，出芽生殖，分裂生殖，营养繁殖
22.有丝分裂前期的特点、有丝分裂后期的特点
23.动植物细胞有丝分裂的差异?前期形成纺锤丝方式不同，植物两极直接发出，动物由中心体发出;末期形成子细胞方式不同，植物赤道面位置形成细胞板，在转变成细胞壁，把细胞一分为二，动物赤道面位置细胞膜内陷，缢缩成两个子细胞
24.细胞分裂后的三种状态?(各举一例)不增殖细胞(神经细胞)、暂不增殖细胞(肝、肾细胞)、增殖细胞(动物骨髓细胞)
25.减数第一次分裂前期的特点?同源染色体联会减数第一次分裂后期的特点?同源染色体分离，非同源染色体自由组合
26.精子和卵细胞形成过程的差异?精子：细胞质均等分裂，一个精原细胞形成四个精细胞;
卵细胞：细胞质不均等分裂，一个卵原细胞形成一个卵细胞精子形成过程有变形
27.细胞分化的特点?稳定、不可逆
28.植物组织培养需要控制的条件?无菌，温度，pH值，光照
29.图解植物组织培养的过程
30.图解克隆绵羊多利的培育过程
高中生物会考的知识31.眼球的折光系统?角膜、房水、晶状体、玻璃体
2.反射弧的组成?感受器传入神经神经中枢传出神经效应器
3.突触单向传递的原因?突触递质的释放为单向的
4.脊髓的功能?反射，传导脑的高级功能?条件反射
5.激素调节的特点?高效性、特异性
6.列举垂体分泌的各种激素?生长素，促甲状腺素、促肾上腺皮质激素、促性腺激素
7.人体免疫的三道防线分别是?机体完整的皮肤和黏膜，吞噬作用，特异性免疫
8.顶端优势的原理?顶芽产生的生长素向下运输，大量积累在侧芽部位，使侧芽的生长受到抑制，顶芽优先生长
9.生长素的化学名称?吲哚乙酸
10.生长素类似物在农业生产上的用途?培育无籽果实，促进扦插枝条生根，防止落花落果
11.自主神经也叫什么，作用是什么?植物性神经;调节控制内脏器官的活动
12.建立条件反射的基本条件是?无关刺激与非条件反射在时间上的结合，即强化
13.神经冲动在一个神经元上的传导形式?生物电
14.听觉和平衡的感受器?耳蜗;前庭器
15.甲状腺素的作用?促进新陈代谢﹑促进生长发育﹑提高神经系统的兴奋性
16.激素调节的基本方式?负反馈
17.人工免疫的主要方式是?接种疫苗
18.生长素的作用
19.胚芽鞘向光性生长的原因
20.听觉形成的过程
21.染色体变异的类型?结构变异的类型?结构、数目变异;缺失，重复，倒位易位
22.物理和化学致变因素各举三例
23.什么是基因突变?有什么特点?
24.变异主要有哪三方面?基因突变，基因重组，染色体畸变
25。图解三倍体无子西瓜的培育过程
26.单倍体育种有什么优点?明显缩短育种年限简述单倍体育种的过程
27.遗传病预防的措施有哪些?禁止近亲结婚、遗传咨询、避免遗传病患儿的出生、婚前体检，适龄生育。
28.秋水仙素使染色体加倍的原理?秋水仙素能够抑制纺锤体形成，导致染色体不分离。
【摘要】
目的:获得稳定表达小鼠IL27(mIL27)基因的小鼠结肠腺癌细胞株(Colon26)，研究IL27基因对小鼠结肠腺癌细胞体内外生物学特性的影响。方法:通过脂质体法将pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒转染结肠腺癌细胞，筛选建立高表达细胞株。采用Westernblot、ELISA、RTPCR法证实IL27基因成功转染Colon26。用MTT比色法检测IL27质粒转染后对Colon26细胞生长的影响;流式细胞术检测IL27质粒转染后对Colon26细胞凋亡的影响;将Colon26IL27细胞接种于BALB/c小鼠的右侧背部皮下，观察其致瘤性。结果:Colon26IL27细胞可表达IL27mRNA并分泌IL27，IL27的表达在体外对Colon26细胞的增殖、凋亡均无影响，而在体内则具有明显的抗瘤活性。结论:成功制备Colon26IL27细胞株，证明IL27能在体内明显抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期，具有一定的抗肿瘤作用。
【关键词】白细胞介素27;基因转染;结肠癌
白细胞介素27（Interleukin27，IL27）是2002年发现并命名的IL6/IL12家族成员，由p28和EBI3两个亚基组成，可作用于固有性免疫和适应性免疫系统的多种免疫细胞而发挥广泛的免疫调节作用。它在Th0向Th1分化的早期调节中起重要作用，可促进Th1型细胞应答，从而增强细胞免疫应答［1］。已知机体免疫系统的抗肿瘤效应机制以细胞免疫为主，因此细胞因子IL27在增强抗肿瘤免疫为策略的生物治疗上应有重要的应用前景。本研究中我们将IL27(mIL27)基因转染小鼠结肠腺癌细胞(Colon26)，并对转染后肿瘤细胞的生物学特征及致瘤性进行了观察，为进一步深入研究IL27的抗肿瘤作用奠定基础。
1材料和方法
1.1材料pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒由本实验室制备保存;脂质体Lipofectamine2000、G418为Sigma公司产品;TRIzolRNA提取试剂盒为GENERAY公司产品;小鼠IL27基因和βactin引物均为上海生物工程公司合成。BALB/c小鼠（4周龄，雌性）由河北医科大学实验动物中心提供。Colon26细胞为本实验室保存。
1.2方法
1.2.1IL27质粒脂质体法转染Colon26细胞大量抽提pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒和pcDNA3.1HisB空质粒，保存备用。转染前24h用胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26细胞，用无双抗、无血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为1×109/L，接种于24孔板，每孔0.5mL，37℃、50mL/LCO2培养箱中培养。当细胞铺满孔底90%～95%时进行转染，转染步骤参见说明书。转染Colon26细胞48h后培养基中加入G418（200mg/L），直至对照孔中的Colon26细胞完全死亡，更换G418浓度（100mg/L）继续筛选至细胞克隆形成，挑取阳性克隆稀释扩增，最终获得转入pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27或pcDNA3.1HisB的Colon26IL27细胞和Colon26HisB细胞。
1.2.2Westernblot检测IL27蛋白表达胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、Colon26HisB细胞和Colon26细胞，裂解细胞，离心取上清，分别加入1×SDSPAGE缓冲液，煮沸10min，在125g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳;电转移法将蛋白转移至硝酸纤维膜上，50g/L脱脂奶粉封闭后相继与抗小鼠HisB单克隆抗体（mAb）和兔抗小鼠的IgG碱性磷酸酶标记二抗反应，BCIP/NBT底物显色。
1.2.3ELISA法检测IL27蛋白表达胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、Colon26HisB细胞和Colon26细胞，裂解细胞，离心取上清，用包被液稀释后加入96孔板，4℃包被过夜，再用50g/L脱脂奶粉37℃封闭1h，相继与抗小鼠HisBmAb和兔抗小鼠的IgG酶标记二抗各反应1h，底物显色30min后测A450值。
1.2.4RTPCR检测IL27的mRNA表达自IL27中间段设计2条引物以检测IL27的mRNA表达，检测产物长度860bp，上、下游引物分别为:5′TGTTGCTGCTACCCTTGCTTCTGG3′;5′AAGGACGTGGATCTGGTGGAGTTG3′。βactin（619bp）上、下游引物分别为:5′AAGAGAGGCATCCTCACCCT3′;5′GGAAGGAAGGCTGGAAG3′。胰酶消化分别收集Colon26IL27细胞、Colon26HisB细胞和Colon26细胞，调细胞密度5×109/L，按照TRIzol总RNA提取法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR扩增:PCR反应参数为:94℃预变性5min;94℃30s，57℃1min，72℃1min，共30个循环;72℃延伸7min。取PCR反应产物10μL，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.5IL27质粒转染后对Colon26细胞生长曲线的影响胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、Colon26HisB细胞和Colon26细胞，用含100mL/LFBS的RPMI1640培养液重悬细胞，每孔104个细胞接种于6块96孔培养板中，37℃、50mL/L
CO2培养箱中培养，第2天始每日取1板，MTT法检测细胞的生长状况，绘制细胞生长曲线。
1.2.6流式细胞术（FCM）检测IL27质粒转染后对Colon26细胞凋亡的影响胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27、Colon26HisB及Colon26细胞1×106个，冷PBS洗2次，700mL/L乙醇固定，碘化丙啶染色，FCM检测各组细胞的凋亡曲线及凋亡蛋白BCL2蛋白的表达。
1.2.7IL27质粒转染后对Colon26细胞成瘤性的影响将小鼠随机分为3组，即Colon26IL27细胞实验组、Colon26HisB组、Colon26组，每组10只。收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、Colon26HisB细胞及Colon26细胞，调整细胞密度为5×108/L，于BALB/c小鼠背部皮下分别注射0.2mL上述细胞悬液。从荷瘤第5天开始，每隔3d用游标卡尺测肿瘤大小，肿瘤大小以体积（V）计算:V(mm3)=1/2×肿瘤最大直径×肿瘤最小直径2(mm3)。
1.2.8统计学分析数据统计分析由SASV8.0软件完成。
2结果
2.1转染pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒细胞具有IL27蛋白表达为证实pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27成功转染Colon26细胞，Westernblot检测IL27蛋白表达。结果显示，Colon26IL27细胞在目的位置出现特异性反应条带，而Colon26HisB细胞和Colon26细胞则无此条带出现(图1)。
图1Westernblot检测转染后各组细胞HisB的表达（略）
1:Colon26IL27细胞;2:Colon26HisB细胞;3:Colon26细胞.
ELISA法检测细胞裂解上清也支持了上述结果，即转染IL27细胞组A值（0.812±0.045）明显高于转染HisB细胞组(0.127±0.009)以及作为对照的Colon26细胞(0.115±0.007)，差异为具有统计学意义（P
2.2RTPCR证明IL27基因的转入以及mRNA的表达分别提取Colon26IL27细胞、Colon26HisB细胞和Colon26细胞的总RNA，经RTPCR扩增后进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，在Colon26IL27细胞中可见1条约860bp的DNA条带，而Colon26HisB、Colon26细胞中均未见到条带(图2)。
2.3IL27质粒转染后对Colon26细胞生长的影响取相同浓度Colon26IL27、Colon26HisB细胞及Colon26细胞连续培养5d，用MTT法检测细胞A值，结果显示，Colon26IL27细胞培养2d、3d、4d、5d、6d的A值分别为0.896、0.757、0.698、0.675、0.610;Colon26HisB细胞培养2d、3d、4d、5d、6d的A值分别为0.896、0.615、0.830、0.700、0.736;Colon26细胞培养2d、3d、4d、5d、6d的A值分别为0.764、0.612、0.813、0.950、1.080，3组细胞的A值无统计学意义。
FCM检测结果表明，3组细胞的凋亡百分率分别为1.01±0.15、0.99±0.11、1.43±0.19;BCL2蛋白表达的FI值分别为1.041±0.09、1.087±0.181，均无统计学意义，说明IL27基因对Colon26细胞的生长和凋亡无影响。
图2RTPCR检测IL27的mRNA表达（略）
M:DNAmarker;1:Colon26IL27细胞;3:Colon26HisB细胞;5:Colon26细胞;2，4，6:βactin.
2.4IL27质粒转染后对Colon26细胞成瘤性的影响分别将Colon26IL27细胞、Colon26HisB细胞和Colon26细胞接种于BALB/c小鼠背部皮下，接种早期(8d)Colon26/IL27细胞组肿瘤生长的速度及大小与Colon26细胞组相似，8d后，Colon26IL27细胞组的小鼠肿瘤生长速度变慢，Colon26IL27组与Colon26HisB细胞和Colon26细胞组相比均有明显的抑瘤作用（P
图3IL27对Colon26细胞成瘤性的影响（略）
3讨论
细胞因子应用于抗肿瘤治疗，取得了一定的效果，IL27因其可促进Th1型细胞应答、增强细胞免疫功能而在肿瘤治疗中日益受到重视。本实验中我们将mIL27基因转染小鼠Colon26细胞，经RTPCR检测证明在Colon26IL27细胞中有mIL27mRNA的表达。ELISA法检测细胞裂解上清，结果表明Colon26IL27细胞可分泌较高水平的mIL27，提示Colon26IL27细胞中转入的IL27基因在mRNA水平和蛋白质水平均可表达，质粒成功转染细胞。体外研究发现，Colon26IL27细胞与Colon26HisB细胞和Colon26细胞相比生长无统计学意义，说明IL27的表达不能直接抑制Colon26细胞的生长。将Colon26IL27细胞接种于BALB/c小鼠皮下，其致瘤性与Colon26HisB细胞和Colon26细胞相比明显降低，肿瘤生长减慢，体积小，荷瘤小鼠生存期延长。上述结果提示，IL27可以在体内抑制Colon26肿瘤细胞的生长。Larousserie等报道称肿瘤细胞本身可能就是IL27的靶子［2］，这与我们发现的IL27在体外并不直接抑制Colon26细胞的生长的结果不一致。
综上所述，我们的研究结果提示，IL27具有一定的抗肿瘤作用，可以明显抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期，Colon26IL27细胞株的建立，为进一步深入研究IL27抗肿瘤作用的体内机制、研制IL27肿瘤治疗疫苗奠定了基础。
参考文献
向重力性反应是植物适应地球重力场环境的一个重要生理过程,是植物能够正常生长发育不可缺少的反应机制。高等植物根的向重力性使其能够充分吸收土壤中的水分和矿质营养,茎的负向重性使其能够充分接受光照。研究表明,植物感受重力与信号传递之间的精确调控可能是通过不同细胞器之间的相互作用来实现的。细胞骨架被认为是与植物向重性有关的重要细胞器之一。细胞骨架(Cytoskeleton)是指真核细胞中的蛋白质纤维网架体系[1]。细胞骨架不仅在维持细胞形态、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用,而且还与细胞运动、物质输运、能量转化、信息传递、细胞分裂和分化、细胞凋亡、细胞的癌变、基因表达等生命活动密切相关。
1植物根系材料的力学特性
植物根系材料不同于一般的工程材料,研究其力学特性,最大的困难在于它参与代谢活动,具有多相、非均匀、各向异性等特点,其应力不仅与应变有关,还与流动因素有关。在不同生理和生长环境下,其力学性质存在很大差异[2]。许多国内外专家学者对木本植物、草本植物、农作物的根系进行了大量的拉伸、压缩、弯曲、冲击、应力松弛、糯变试验等研究,得到了少数根系的拉伸最大载荷、应力、应变、弹性模量、弯曲应力等参数,得到了个别根系的冲击韧性、应力松弛、糯变试验数据和曲线,推得了本构方程、应力松弛方程和糯变方程等。尽管这些研究成果是初步的、不全面的,但它们已在防风治沙、防水土流失等生态环境建设工程中发挥了重要作用,为植物根系力学的进一步发展奠定了基础。
2植物感受重力的2种假说
植物重力信号感受机制一直是生物学界争论不休的话题。截至目前对于重力信号感受的解释主要有2种,即淀粉平衡石假说与原生质体压力假说。
淀粉平衡石假说认为,重力信号是由一类结构特殊的细胞即平衡细胞来感受的。在根中平衡细胞是位于根冠的柱状细胞,而在下胚轴和花序轴中平衡细胞是内皮层细胞。这2种细胞都是高度极化的细胞,但存在结构上的特异性。平衡细胞的细胞核位于细胞的中部或顶部,细胞质可以分为2层,包含内质网的周边区域和富含肌动蛋白微丝的中央区域。平衡细胞最显著的结构特征是都含有淀粉体[3]。淀粉体起平衡石的作用,其比重大于细胞质。在垂直生长的器官中,这些淀粉体沉降在细胞的底部,当植物器官在重力场中的方向发生改变,这些淀粉体因为比重较大,重新沉降到新的物理学底部。中柱细胞和内皮层细胞就是通过这些淀粉体的沉降来感受重力的变化。
原生质体压力假说是平衡石假说之外的另一种关于重力感受的假说。在拟南芥无淀粉体的突变体中,尽管重力敏感性降低,但给予植物长时间的重力刺激,其根仍能发生一定程度的向重力方向弯曲。因此,有人认为在植物体中除了结构特异的平衡细胞外,植物的原生质体本身也可以感受到重力的改变。原生质体压力假说的主要内容是:当植物体的原生质体在重力场中的取向发生改变时,原生质体上部的细胞膜与细胞壁之间的张力增强;这种张力的改变通过特异的区域,即细胞膜与细胞壁通过细胞骨架相连接的区域,传递到细胞膜上改变细胞膜的张力,从而活化质膜上张力敏感的离子通道,特别是钙离子通道;胞质中钙离子浓度的改变引发下游的信号传导,最终引起植物器官的向重性弯曲。
3细胞骨架结合蛋白在重力信号传导链中的作用
3.1微丝结合蛋白
细胞骨架结合蛋白可分为微丝结合蛋白(ABPs)和微管结合蛋白(MAPs)。在植物中研究得最清楚的ABPs是微丝单体结合蛋白以及抑制蛋白和微丝解聚因子,如ADF/丝切蛋白。这2类蛋白都是由多个基因家族编码,在微丝骨架组成方面起着重要的作用。过量表达ADF的拟南芥植株生长缓慢,细胞纵向的微丝束消失;而抑制ADF表达则可刺激细胞伸展和细胞伸长生长,同时细胞形成粗的纵向微丝束。细胞周边部位的微丝网络可能是这一蛋白的作用靶点,但是由于周边微丝的动态性与不稳定性,通常很难通过图像观察到其变化[4]。重力刺激可能调控某些细胞骨架结合蛋白的活性,进而引起细胞骨架重组。如在受到重力刺激的早期拟南芥根的柱状细胞和玉米的胚芽鞘细胞质的pH值发生改变,ADF的活性受到磷酸化与去磷酸化的调控。在高的pH值条件下ADF调控微丝的解聚,并可能因此改变平衡细胞中微丝骨架的动态性。
3.2微管结合蛋白
与微丝相似,微管重组的过程中微管聚合和解聚的调节可能与结合蛋白有关。利用拟南芥突变体分析微管结合19蛋白的功能取得了巨大的进展。最近发现的细胞壁束间纤维束机械强缺失突变体(fra2)和下胚轴减少伸长突变体(botero1)都表现为周边微管的扰乱。
4细胞骨架与高等植物向重性的关系
细胞骨架不仅在维持细胞形态、承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用,而且还参与许多重要的生命活动。如在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离;在细胞物质运输中,各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运;在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。
研究认为,细胞骨架一方面在细胞质中形成网络,受到沉淀的淀粉体的牵动,另一方面与质膜上的受体相互作用,激活受体,启动重力信号传导过程。最近的研究表明,细胞骨架不仅是细胞感受重力信号的重要环节,而且对根尖细胞中的生长素运输起重要的调控作用。对生长素运输载体(PIN)突变体根向重力性反应的研究表明,生长素的极性运输与其向重力性反应有关。微丝解聚剂(如cytochalasin)可减少生长素的极性运输,也影响根的向重力性[5]。
5结语
细胞骨架和植物细胞向重性研究表明,植物向重性现象是一个集研究细胞骨架排列、信号传导、植物激素行为、植物生长调控于一体的完美系统。传统的研究细胞骨架和植物向重性的方法已加入了新的生物学技术,如免疫荧光技术、套笼探针技术和其他新发展的显微技术。免疫荧光技术可以观察到向重力性过程中细胞骨架的重排,套笼探针的微注射技术可以观察到细胞骨架的实时动态变化过程[6]。利用修饰细胞骨架的荧光报告蛋白可以观察到活细胞中细胞骨架的变化,采用荧光蛋白显示剂监测细胞质中钙和pH值变化已用于保卫细胞中信号传导的研究,以及根的发育和向重力性的研究。
6参考文献
[1]刘贻尧,王伯初.植物对环境应力刺激的生物学效应[J].生物技术通讯,2000(11):219-222.
[2]段传入,王伯初,王凭青.水稻茎的结果及其性能的相关性[J].重庆大学学报,26(11):11-13.
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