生物细胞分析范例(12篇)
时间：2024-04-03
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[关键词]UF-50全自动尿沉渣分析仪;H-500尿液分析仪;影响因素
[中图分类号]R446.12[文献标识码]B[文章编号]1673-7210(2010)04(c)-103-02
UF-50全自动尿沉渣分析仪与H-500尿液分析仪使用方便、快速、准确率较高,但在实际工作中发现它们有一定的误差,现报道如下:
1材料与方法
1.1材料
收集我院住院患者晨尿20ml于2h内送检。2009年1～6月共收集尿液标本5459例,其中,男3026例,女2433例;年龄1d～108岁。
1.2仪器与试剂
日本Sysmax公司生产的UF-50全自动尿沉渣分析仪及其配套试剂和质控品;DIRUI生产的H-500尿液分析仪及配套试剂;日本欧林巴斯光学工业株式会社生产的Olympus显微镜,普通离心机和带刻度试管。
1.3方法
工作前做仪器的每日质控,质控在控时方进行标本的检测。将10ml尿液标本混匀后先在H-500尿液分析仪上测试,再在UF-50尿沉渣分析仪上测试,最后以相对离心力400g离心5min,弃去上清液,留取0.2ml尿液并混匀尿沉渣,取20μl涂片,用18mm×18mm加盖玻片后镜检,观察细胞成分为10个高倍视野取均值。三种试验均在2h内完成,超出H-500、UF-50分析仪报警限值和显微镜镜检的正常参考值范围的结果即分别为各自的阳性结果。
1.4正常参考值
UF-50尿沉渣分析仪报警限值,红细胞:男性0～12个/μl,女性0～24个/μl,白细胞:男性0～12个/μl,女性0～25个/μl。显微镜镜检正常参考值范围:红细胞0～3个/HP,白细胞0～5个/HP。
2结果
UF-50的检测简称沉渣仪法,H-500的检测简称干化学法,显微镜镜检简称镜检法,三种方法的检测结果见表1。UF-50尿沉渣分析仪检测5459例尿液标本假阳性结果(以镜检法为“金标准”,与之不符的阳性可视为假阳性)分析见表2。UF-50尿沉渣分析仪检测5459例尿液标本假阳性结果影响因素分析见表3。
3讨论
H-500尿液分析仪及其配套使用的H系列尿液分析试纸条检测白细胞的原理是吡咯酚酯在中性粒细胞中酯酶的水解作用下,产生游离酚,游离酚与苯基重氮盐偶联,生成紫色染料,根据试纸条紫色的有无和深浅来定性或定量白细胞的有无和多少,但这受到一定因素的影响:淋巴细胞和单核细胞不含酯酶,不能产生游离酚而呈假阴性;高比重尿、淋巴细胞尿、高葡萄糖尿及室温20℃以下均可造成白细胞结果偏低或呈假阴性[1];另外,某些大剂量的药物,如头孢霉素和庆大霉素可抑制显色反应而致假阴性[2]。检测红细胞的原理是血红蛋白具有过氧化物酶样活性,可使过氧化物分解新生态氧,新生态氧氧化指示剂,使指示剂出现颜色变化,根据试纸条颜色的有无和深浅来定性或定量红细胞的有无和多少。红细胞破碎和溶解及血红蛋白释放入尿中引起阳性反应(镜下看不到完整的红细胞);肌红蛋白也具有过氧化物酶活性而呈假阳性;尿中含有的对热不稳定的酶或细菌(白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌)释放的过氧化物酶活性物质或由于细菌代谢繁殖过程中合成的触酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶而产生假阳性结果[3];某些氧化性污染物,例如次氯酸盐会导致假阳性;大量的维生素C可致假阴性,某些药物,如利福平可降低红细胞的反应性而出现假阴性。本研究显示白细胞检测镜检法比干化学法有更高的阳性率,红细胞检测干化学法比镜检法有更高的阳性率,这与有关报道基本一致[4-5]。
UF-50全自动尿沉渣分析仪是使用全自动流式细胞技术和电阻抗原理,通过对前向散射光波形(散射光强度和散射光脉冲宽度)、荧光波形(荧光强度和荧光脉冲宽度)和电阻抗值的大小综合分析,得出细胞的形态、细胞横截面积、染色片段的长度、细胞容积等信息并绘出直方图和散射图。仪器通过分析每个细胞信号波形的特性来对其进行分类[6]。但各检测项目和其相应影响因素在形态、大小、染色性方面有相似之处。因此,该机器还不能严格区分各类成分。本结果表2中反映尿中红细胞假阳性率较高,而白细胞假阳性率较低;表3表明红细胞的假阳性主要由结晶(哑铃形草酸钙结晶居多)、酵母样菌、细菌和(男性尿中)引起。草酸钙结晶、酵母样菌、和成团的细菌与尿中红细胞具有相似的荧光和前向散射光特性,造成仪器误判。本市地处南方,天气炎热而潮湿,尿液久置易生菌,酵母样菌引起的假阳性有相当高的比率,达到37.8%。尿中白细胞假阳性主要由结晶、小圆上皮细胞、细菌和红细胞过多引起,分别达到34.5%、33.6%、22.7%和9.2%,原理和红细胞相似。
综上所述,H-500尿液分析仪与UF-50尿沉渣分析仪作为自动化仪器,与传统手工法相比,具有操作规范化、检测自动化、总体准确性、重复性好,同时检测多个项目、高效快速等优点,但在检测红细胞和白细胞的项目中,由于各自检测原理技术的原因,分别存在一定数量的假阳性和(或)假阴性,必要时应结合手工显微镜镜检以保证尿液分析的检验质量。
[参考文献]
[1]丛玉隆.尿液沉渣标准化的建议[J].中华检验医学杂志,2002,25(4):249-250.
[2]李卫滨,王德春,林宝顺,等.尿液分析仪检测假阴性的问题探讨[J].临床检验杂志,2000,18(1):47.
[3]徐银萍,王胜奎.尿液分析仪与尿沉渣镜检两种方法的比较分析[J].现代检验医学杂志,2006,21(3):71-72.
[4]桂满元.尿红细胞3种检测方法的结果差异及影响因素分析[J].检验医学与临床,2008,5(2):138.
[5]李颖.尿液分析仪不能取代手工检验[J].海南医学,2008,19(2):122.
一、生物膜概念模型二、生物膜考点例析
考点1生物膜的成分、结构模型和结构特点
1.组成成分：所有生物膜都含磷脂和蛋白质，功能越复杂的生物膜，其内蛋白质含量和种类越多.细胞膜外表面含糖蛋白，在癌细胞的表面糖蛋白等物质减少而使其易扩散和转移.动物细胞膜中含少量胆固醇，以调节细胞膜的流动性.
2.结构模型：生物膜的流动镶嵌模型是1972年由桑格和尼克森提出，其基本内容是：磷脂双分子层构成生物膜的基本骨架，具有流动性.蛋白质分子以镶在表面、不同程度嵌入及贯穿等形式分布在其中，大多数蛋白质分子可以运动.糖蛋白分布在细胞膜的外侧，具有保护和、细胞识别及信息交流等功能.
3.结构特点：生物膜具有一定的流动性，其中细胞膜的流动性是细胞完成很多生命活动的必要条件，如变形虫的运动、植物细胞的质壁分离和复原、红细胞失水皱缩和分泌蛋白的胞吐等.
例1细胞膜在细胞的生命活动中具有重要作用.下列相关叙述不正确的是（）.
A.细胞膜的糖被在细胞间具有识别作用
B.吞噬细胞对抗原的摄取需依赖细胞膜的流动性
C.细胞膜内外两侧结合的蛋白质种类有差异
D.载体蛋白是镶在细胞膜内外表面的蛋白质
答案:D
解析细胞间的识别由糖被来实现；吞噬细胞对抗原的摄取属于胞吞作用，需依赖细胞膜的流动性；膜内外两侧的蛋白质种类有别，如糖蛋白只存在于细胞膜的外侧；载体蛋白可协助物质跨膜运输，应嵌插膜中，而不是镶在细胞膜内外表面，故D错.
考点2生物膜系统的结构和功能联系
1.生物膜系统：指具有联系的细胞膜、核膜及具膜的细胞器.真核细胞有生物膜系统，注意原核细胞和哺乳动物成熟红细胞只有细胞膜，无生物膜系统.
2.不同生物膜特点：内质网膜在细胞中含量高、分布广泛；细胞膜、内质网、高尔基体、液泡和溶酶体均为单层膜.叶绿体、线粒体和核膜均为双层膜，叶绿体通过类囊体垛叠成基粒扩大内部膜面积，线粒体内膜折叠成嵴以扩大膜面积；核膜上有核孔，以实现核质间大分子物质选择性和双向换，可让蛋白质进核和RNA出核，但不让核DNA出核，代谢旺盛的细胞中核孔一般较多.
3.生物膜系统结构联系：细胞中内质网膜向外连细胞膜，向内连外层核膜，有些细胞中还与线粒体膜相连；内质网与高尔基体间，高尔基体与细胞膜间可通过具膜小泡实现结构联系.
4.生物膜功能联系：分泌蛋白的加工和运输与内质网、高尔基体、线粒体和细胞膜有关，注意：蛋白质合成场所是核糖体，其无膜结构，不属于生物膜系统.（见下面图）
例2下列有关生物膜结构和功能的描述，不正确的是（）.
A.植物原生质体的融合依赖于细胞膜的流动性
B.合成固醇类激素的分泌细胞的内质网一般不发达
C.分泌蛋白的修饰加工由内质网和高尔基体共同完成
D.生物膜之间可通过具膜小泡的转移实现膜成分的更新
解析植物体细胞杂交中原生质体的融合依赖于细胞膜的流动性；光面内质网参与脂质的合成，因此合成固醇类激素的分泌细胞中的内质网一般比较发达；核糖体合成的多肽链经过内质网和高尔基体的修饰加工才形成分泌蛋白；在分泌蛋白的成熟过程中，内质网、高尔基体与细胞膜间通过具膜小泡来实现物质的转运，这里实现了生物膜成分的更新.答案：B
考点3细胞膜的物质运输功能和跨膜层数的计算
1．选择透过性：细胞膜给细胞提供相对稳定的内部环境，其控制物质进出细胞，细胞膜是选择透过性膜.细胞衰老后细胞膜的通透性发生变化，物质运输功能降低.
2.小分子物质运输方式：气体分子（如O2、CO2等）、水、甘油、乙醇和苯等小分子物质跨膜运输方式是自由扩散.氨基酸、葡萄糖及离子（如Na+、K+）等物质在细胞膜上载体蛋白协助下进行协助扩散；在膜上载体蛋白协助和消耗能量条件下进行逆浓度梯度的主动运输.当甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等作为神经递质时，由突触前膜通过胞吐方式排出，以增加神经递质释放量，加快兴奋传递.
3.大分子物质运输方式：大分子物质进出细胞需依靠细胞膜的流动性完成，如蛋白质通过胞吐排出细胞，细菌和病毒等颗粒型物质通过胞吞进入细胞.
4.物质穿越膜层数的计算：（1）常涉及到的细胞结构的膜层数：线粒体和叶绿体均为2层膜，液泡、细胞膜均为1层膜，核糖体、核膜上的核孔均为0层膜等.（2）常涉及到结构和细胞：由于肺泡壁、毛细血管壁、毛细淋巴管壁、小肠粘膜上皮、肾小囊壁、肾小管壁细胞等均为单层上皮细胞，物质在穿越这些细胞时均穿越了两层细胞膜.（3）常涉及到的生理过程：营养物质的吸收、分泌蛋白的合成与分泌、泌尿、血液循环、神经传导、光合作用、呼吸作用等.
例3下图为细胞膜结构及物质跨膜运输示意图，下列有关叙述正确的是（）.
A．O2和CO2以图中a方式通过细胞膜
B．被动运输过程一定不需要膜蛋白的参与
C．人小肠中的葡萄糖被吸收到体内成为肝糖原，至少需穿过7层图示膜
D．图中①②④都能运动，而③一般不能运动
解析由图可知，①是糖蛋白，其外侧是细胞外部，②④为蛋白质，③是磷脂双分子层，a、c是蛋白质分子，为主动运输过程；b、d为自由扩散过程；氧气和二氧化碳是自由扩散过程，不需载体蛋白质参与，A错误；协助扩散是被动运输过程，需载体蛋白参与，B错误；小肠中的葡萄糖需要穿过小肠绒毛壁和毛细血管壁才能进入血浆成为血糖.再经过血液循环，穿越毛细血管到达组织液，进入肝细胞内合成肝糖原,小肠绒毛壁和毛细血管壁都是由一层上皮细胞围成，而穿过每一层细胞都需穿过2层细胞膜，因此此过程中葡萄糖至少穿过7层膜；图中的①②③④具有一定流动性，D错误.答案:C
考点4细胞膜的信息交流功能
1.非受体介导：高等植物相邻细胞的细胞质间存在胞间连丝，携带信息的物质可通过胞间连丝进入另一个植物细胞进行信息交流，此过程不需受体介导.
2.受体介导：信号分子（如激素、神经递质和淋巴因子等）与受体结合具有特异性.细胞分泌的激素（如胰岛素）随血液到达全身各处，与靶细胞的细胞膜表面的受体结合，进而把信息传递给靶细胞；注意性激素和甲状腺激素作用靶细胞时，其进入靶细胞内部并与细胞内受体结合完成信息传递.相邻两个细胞的细胞膜直接接触，信息可从一个细胞传递给另一个细胞，如识别卵细胞，效应T细胞接触靶细胞等；反射弧的突触中，突触前膜释放的神经递质经突触间隙扩散到突触后膜，进而和突触后膜上特异性受体结合后完成信息传递.
例4眼可视物、舌可尝鲜、鼻可嗅味，是因为这些感官细胞的细胞膜上分布着一类特殊蛋白质，统称G蛋白耦联受体(GPCR).美国科学家莱夫科维茨和克比尔卡因为突破性地揭示GPCR的内在工作机制而获得2012年诺贝尔化学奖.下图为评委会现场解释他们的研究成果所展示的图片之一，据此下列相关说法中错误的是（）.
A．信息分子主要是指激素和神经递质
B．GPCR的化学本质是糖蛋白
C．信息分子与GPCR的结合不具有特异性
D．GPCR可将胞外信息传递给G蛋白
解析信息分子主要指激素和神经递质，其和GPCR的结合具有特异性，结合后进而将胞外信息传递给G蛋白，进而调节靶细胞的生理功能.答案:C
例5下图①②③表示人体细胞间信息传递的三种主要方式.下列描述错误的是（）.
A．方式①②的信息传递缓慢，方式③传递迅速
B．方式③的信息传递不通过体液
C．体温调节可能涉及①②③三种传递方式
D．①②方式的信息传递都经过血液循环，存在反馈调节
解析图中神经内分泌是下丘脑.方式③的信息传递要经过突触，突触间隙中是组织液，是体液成分.A选项符合激素调节与神经调节的异同，C选项考查体温调节的过程，D选项考查激素调节的反馈调节.答案:B
三、变式训练
1.真核细胞进行的下列活动中，不依赖于生物膜结构的是（B）.
A．合成有生物活性的胰岛素B．形成乳酸
C．产生O2D．传导兴奋
2.下列关于真核细胞生物膜的叙述，正确的是（A）.
A．生物膜的特定功能主要由膜蛋白决定
B．构成膜的脂质主要是磷脂、脂肪和胆固醇
C．有氧呼吸及光合作用产生ATP均在膜上进行
D．核糖体、内质网、高尔基体的膜部都参与蛋白质的合成与运输
3.线粒体是真核细胞进行有氧呼吸产生ATP的主要场所，下列关于线粒体膜结构的分子模型，正确的是(C).
4.下列关于生物膜结构和功能的叙述正确的是(A).
A.肌细胞的细胞膜上有协助葡萄糖跨膜运输的载体
B.细胞膜上的受体是细胞间信息交流所必需的结构
C.线粒体内膜上只分布着合成ATP的酶
D.核膜上的核孔可以让蛋白质和RNA自由进出
5.下列关于生物膜的叙述，不正确的是（A）.
A．细胞完成分化以后，其细胞膜的通透性稳定不变
B．膜的流动性是细胞生物膜相互转化的基础
C．特异性免疫系统通过细胞膜表面的分子识别"自己"和"非已"
D．分泌蛋白质合成越旺盛的细胞，其高尔基体膜成分的更新速度越快
6.下图是某一种植物的一个叶肉细胞中的两种生物膜结构，以及在它们上发生的生化反应.下列有关的说法中，欠妥当的一项是（C）.
A．①具有吸收、传递和转换光能的功能，②的化学本质是蛋白质，
B．如果A中的O2被B利用，至少要穿过4层生物膜
C．B中的［H］是丙酮酸分解为CO2时产生的
D．B通过内膜向内折叠形成嵴以增大化学反应的膜面积，从而为适应其功能提供必要的条件
7.有关生物膜结构与功能的叙述，正确的是(C).
A．膜载体蛋白的合成不需要ATP
B．葡萄糖跨膜运输不需要载体蛋白
C．线粒体外膜与内膜的主要功能不同
【摘要】目的观察3，6二羟黄酮对HL60细胞的影响。方法分别用台盼蓝拒染观察药物对细胞的毒性作用，流式细胞术、Hoechst33258/PI荧光双染和琼脂糖凝胶电泳观察药物对细胞周期的影响以及凋亡情况。结果3，6二羟黄酮对HL60细胞具有明显地细胞毒作用，呈一定的时效性；流式细胞术、荧光双染和琼脂糖凝胶电泳实验，发现了典型的凋亡细胞，且随药物浓度的增加，凋亡细胞数明显增加；然而统计学分析发现3，6二羟黄酮并没有引起HL60细胞周期的变化。结论3，6二羟黄酮能明显地抑制HL60细胞的增殖，并能引起细胞的凋亡。
【关键词】3，6二羟黄酮；HL60细胞株；凋亡
【Abstract】ObjectiveToobserveeffectof3，6dihydroxyflavoneontheproliferationofHL60celllines.MethodsTheeffectof3，6dihydroxyflavoneontheproliferationofHL60celllineswasdetectedbyTrypanbluedyeexclusionassay，thechangesofthecellcyclewasanalyzedbyflowcytometry(FCM)，theapoptosiswasanalyzedbyFCM，Hoechst33258/PIfluorescencestainingandDNAagarosegelelectroporesis.Results3，6dihydroxyflavonehadstrongcytotoxicitytoHL60celllineswithdependenceoftime，Whileabnormalityofcellcyclescouldnotbeinduced.Aftertreatedwith3，6dihydroxyflavonefor36h，HL60celllinecouldbeinducedapoptosis，whichwasconfirmedbyFCM，fluorescencestainingandDNAagrosegelelectroporesis.ConclusionConclusion3，6dihydroxyflavonecouldstronginhibittheproliferationofHL60celllinesandcouldinduceapoptosis.
【Keywords】3，6dihydroxyflavone;HL60celllines;apoptosis
白血病是一种血液恶性肿瘤，白血病细胞丧失分化、成熟的能力以及异常增殖，致使恶性细胞在体内积累。白血病对人体有极大的危害，发病率较高，为2.76/10万，白血病的治疗在当今世界上仍是一大难题。有关3，6二羟黄酮（化学结构见图1）与肿瘤细胞关系的报道很少，仅有学者研究了它对几种不同的细胞周期的影响［1］，发现30μmol/L的3，6二羟黄酮能升高SF295、SKOV3、HCT15、HCT15/CL02等多种癌细胞株S期细胞数。本实验首次在体外观察3，6二羟黄酮对人早幼粒白血病细胞株HL60生长增殖的影响，并探讨其抗肿瘤作用与细胞凋亡的关系。
图13，6二羟黄酮的化学结构（略）
材料与方法
1.材料3，6二羟黄酮购于美国Aldich公司；人早幼粒白血病细胞株HL60为广东医学院生化所保存；RPMI1640购于美国Gibco公司；新生小牛血清购于杭州西季青生物公司；PI、EB、RNaseA、Hoechst33258均购于美国Sigma公司；其余为国产分析纯产品。
2.细胞培养人早幼粒白血病细胞株HL60培养于含有10%灭活的小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640完全培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度孵箱孵育，取对数生长期细胞实验。
3.药物的配制用DMSO配成原液，分装冻存，临用前用DMSO稀释成所需浓度。药物作用于细胞时，DMSO的终浓度等于0.1%（v/v），实验表明该浓度对细胞生长增殖无影响。
4.台盼蓝拒染法检测3，6二羟黄酮对HL60细胞生长增殖的影响参考文献［2］收集对数生长期的细胞，PBS洗3次，调整细胞浓度0.5×105～1.0×105/ml，分装于24孔板，每孔1ml，加入1μl不同浓度药物，每组设4个平行孔，并设空白对照孔。细胞加药后置于37℃、5%CO2饱和湿度孵箱培养，加入台盼蓝染色，用台盼蓝拒染法在镜下计活细胞数，按下式计算不同浓度的药物对细胞的生长、增殖抑制率（IR）。抑制率（Inhibitoryrate，IR）=（1用药组活细胞数/空白组活细胞数）×100%；按改良Karber公式计算IC50：
IC50=XmI×（P-3PmPn4）
【其中I=log(最大剂量/相邻剂量)；Xm=log最大剂量；P=阳性反应率之和；Pm=最大阳性反应率；Pn=最小阳性反应率】
5.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡细胞参照文献［3］，略有改动。分别收集不同浓度药物处理的细胞1.0×106，PBS洗3次，用70%（v/v）的冷乙醇4℃固定过夜。上机前收集细胞，用PBS洗涤细胞除去乙醇，用碘化丙啶（PI）染液（含20μg/mlPI，0.25μg/mlRNaseA），室温染色30min。过滤，流式细胞仪（FCM）检测，资料经LysisⅡ收集、贮存、分析。
6.荧光染色参照文献［4］，略有改动。收集对数生长期的细胞，PBS洗3次，调整细胞浓度2.0～3.0×105/ml，加入6孔板中，加入不同浓度的药物，并设空白对照组，处理一定时间后，收集细胞，加入荧光染料Hoechst33258和PI，至其终浓度分别为10μg/ml和20μg/ml，37℃避光染色30min，紫外光激发，荧光显微镜下观察细胞核的形态及颜色改变以区分出正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并拍照。
7.琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段化参照文献［5］，略有改动。收集107细胞，PBS洗涤离心沉淀细胞，用50μl裂解液（1%NP-40、20mmol/LEDTA、50mmol/LTrisHClpH=7.5）处理细胞10s，1500g离心5min，收集上清液，再用50μl裂解液重复处理1次，合并上清液，加10%SDS，2μl10mg/mlRNaseA，混匀，37℃水浴2h，加入4μl20mg/ml蛋白酶K于56℃处理2h，加入70μl10mmol/LNH4Ac，600μl无水乙醇沉淀DNA，4℃，15000g，离心15min，真空干燥，TEBuffer溶解DNA，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（恒压），观察并拍照。
8.统计学处理计量资料以-±s表示，采用SPSS11.0进行单因素方差分析，P＜0.05为有统计学差异。
结果
1.台盼蓝拒染法检测药物的细胞毒性作用不同浓度的3，6二羟黄酮分别作用于人早幼粒白血病细胞株HL60不同时间，用台盼蓝拒染法观察它的增殖抑制效果。结果表明（见表1）：当时间不变时，随着3，6二羟黄酮剂量的增大，对HL60细胞株抑制作用增强，且呈剂量依赖性；在同一药物浓度情况下，随着药物作用时间的延长，药物对细胞株增殖的抑制作用也有所增强，呈时间依赖性。当0～160μmol/L的3，6二羟黄酮分别处理细胞12h、24h和36h，计算其半抑制浓度IC50值分别为166.79μmol/L、59.01μmol/L、22.94μmol/L。选择36h作为后续研究的作用时间。
表13，6二羟黄酮对人早幼粒白血病细胞株HL60的细胞毒性作用（略）
注：与0μmol/L组比较，P＜0.05，P＜0.01
2.流式细胞仪检测结果当细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶激活使DNA广泛降解、断裂，DNA结构发生剧变，细胞内总DNA量降低。流式细胞仪（FCM）可以检测凋亡时DNA的这种结构及量的变化，于正常G0/G1细胞期前出现一DNA低染细胞群，称“A0细胞群”即凋亡细胞群。当药物浓度在0～160μmol/L范围内，3，6二羟黄酮作用HL60细胞36h，对细胞周期无明显影响（P均＞0.05），却能导致HL60细胞的明显凋亡，当药物浓度为40μmol/L时，开始出现凋亡峰，凋亡率为2.5%，当药物浓度达160μmol/L时，凋亡率达38.5%（见图2及表2）。
A：对照B：10μmol/LC：40μmol/LD：160μmol/L
图23，6二羟黄酮作用HL60细胞36h后流式细胞仪分析图谱（略）
表23，6二羟黄酮作用HL60细胞36h对细胞周期的影响（略）
3.荧光染色结果凋亡细胞细胞膜通透性有所增加，因此，药物处理后的细胞经Hoechst33258/PI双重染色后，外形不规则被染成红色荧光的细胞为坏死细胞；细胞体积缩小而完整，被染成亮蓝色的是凋亡细胞；而正常活细胞对染料有拒染性，细胞核成均匀弥散浅蓝色荧光。荧光双染结果（见图3）显示，3，6二羟黄酮处理过的HL60细胞，可以见到典型的凋亡细胞，且随着药物浓度的增加，凋亡细胞数目明显增加。
A：对照B：10μmol/LC：40μmol/LD：160μmol/L
图33，6二羟黄酮作用HL6036h经Hoechst33258/PI染色荧光显微镜下观察图谱（×200）（略）
4.DNA断裂的凝胶电泳图谱分析凋亡的主要生化标志是内源性钙镁离子依赖性核酸内切酶被激活，导致细胞DNA广泛断裂，形成大小不一的DNA片段，从而在琼脂糖电泳上呈现规则的、间隔180～200碱基对的“DNA梯”。图4显示不同浓度的3，6二羟黄酮作用HL60的DNA断裂的凝胶电泳图谱，当药物浓度较低时，未出现“梯”，且在同一分子量位置出现了分子量较大的一条带，表明未发生凋亡，也可能是由于发生凋亡的细胞数未达到出现“DNA梯”的细胞数；随药物浓度的增加，“梯”现象更加明显。
图43，6二羟黄酮处理HL60细胞株36hDNA断裂凝胶电泳图谱（略）
A：对照B：10μmol/LC：40μmol/LD：160μmol/LM：100bpDNAmarker
讨论
肿瘤的形成是基因调控的细胞增殖失控、分化异常和（或）细胞凋亡过程受到抑制两方面共同作用所致。因此，诱导肿瘤细胞凋亡对肿瘤的发生发展机制的研究及其治疗，都具有十分重要的意义。由于抑制细胞增殖的可能机制主要有三种：一是引起细胞的死亡（包括凋亡）；二是引起细胞周期各时相的等比例延长；三是细胞被阻滞在周期中的某一个时相。为探讨3，6二羟黄酮对HL60细胞的影响情况，本实验采用了台盼蓝拒染法和流式细胞术等方法。结果发现：3，6二羟黄酮对HL60细胞有明显的细胞毒作用，呈一定的时效性；流式细胞术和Hoechst33258/PI荧光双染实验，均发现典型的细胞凋亡现象，且随药物浓度的增加，凋亡细胞数明显增加；然而统计学分析显示3，6二羟黄酮并没有引起HL60细胞周期的变化。提示3，6二羟黄酮对HL60细胞的细胞毒作用，可能主要是通过诱导细胞凋亡而发挥作用的。此外，3，6二羟黄酮能提高细胞核酸内切酶的活性，从而使其DNA电泳图谱上观察到明显的ladder出现。
凋亡是细胞受到某些因素刺激后一种主动的由凋亡相关基因调控的“自杀”过程，亦称细胞程序性死亡，是细胞在其分裂、增殖、分化和衰老死亡中具有十分重要作用的生物学现象。它在维持细胞内环境稳定，维持机体的正常发育和组织状态有重要意义。生理性细胞凋亡机制紊乱将导致发育异常和加速肿瘤发生和恶化。故有人提出肿瘤生长的主要原因不是肿瘤细胞受刺激大量增殖的结果，而是细胞凋亡抑制剂和肿瘤促进剂等延长了已转化的细胞生存期限的结果。促进和诱导细胞凋亡是治疗肿瘤和逆转肿瘤细胞耐药的一种新思路，也是当今抗肿瘤研究的热点之一。
本文从DNA片段化分析，细胞形态学分析证明3，6二羟黄酮具有诱导HL60细胞凋亡的作用，但有关其诱导凋亡的具体机制未清。然而，本课题组实验证明3，6二羟黄酮在胞外能显著抑制重组人蛋白激酶CK2的活性［6］，但是却对细胞内CK2活性没有明显的影响（数据未列出），因此其诱导HL60细胞凋亡的机制可能与胞内CK2的活性无关，怀疑可能与CK2在细胞内的核定位有关。有些研究表明［7］：CK2的亚细胞定位是高度动态的。Guo等［8］提出，一些化学诱导的凋亡可能引起细胞核基质内CK2活性的升高，这可能是因为CK2从胞质中被转运到核间隔中，CK2穿梭到核基质可能是对化学诱导的凋亡的一种保护性行为。转染了CK2α基因的细胞能明显抑制化学诱导的凋亡，而相应的核基质内的CK2有所升高，因而他们提出CK2在抑制细胞凋亡方面发挥了作用。2001年1月在智利召开的第三届蛋白激酶CK2国际会议上，更是进一步提出CK2有抑制细胞凋亡的功能。接着，Pinna实验室［9］又证实了目前最特异的CK2抑制剂TBB，能诱导Jurkat细胞的凋亡。另外，这可能与凋亡基因Capse家族有关（Caspse家族是CK2的底物之一）。有研究发现，CK2的抑制剂——槲皮素、芹黄素、杨梅黄酮能够通过刺激Caspse3和Caspse9的活性而诱导HL60细胞的凋亡［10］。相信，随着研究的进一步深入，将对指导临床对白血病的治疗产生重要的现实意义。
参考文献
［1］ChoiSU，RyuSY，YoonSK，etal.Effectsofflavonoidsonthegrowthandcellcycleofcancercells［J］.AnticancerRes，1999，19(6B):5229-5233.
［2］韩锐.抗癌药物研究与实验技术（修订本）［M］.北京:北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社，1975，281-282.
［3］NicolettiI，MiglioratiG，PagliacciMC，etal.Arapidandsimplemethodformeasuringthymocyteapoptosisbypropidiumiodidestainingandflowcytometry［J］.JImmunolMethods，1991，139(2):271-279.
［4］DarzynkiewiczZ，BrunoS，DelBinoG，etal.TraganosF.Featuresofapoptoticcellsmeasuredbyflowcytometry［J］.Cytometry，1992，13(8):795-808.
［5］HerrmannM，LorenzHM，VollR，etal.ArapidandsimplemethodfortheisolationofapoptoticDNAfragments［J］.NucleicAcidsRes，1994，22(24):5506-5507.
［6］李春梅，刘新光，林小聪，等.3，6二羟黄酮对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析［J］.中国药学杂志，2004，39（12）：903-906.
［7］MontenarhM.ProteinkinaseCK2:insearchforitsregulation［J］.AduClinExp，2003，12：15-22.
［8］GuoC，YuS，DavisAT，etal.ApotentialroleofnuclearmatrixassociatedproteinkinaseCK2inprotectionagainstdruginducedapoptosisincancercells［J］.JBiolChem，2001，276(8):5992-5999.
关键词细胞增殖染色体分裂
中图分类号：G633.91文献标识码：A
1教材分析
《细胞增殖》是新人教版《普通高中课程标准试验教科书生物1（必修）――分子与细胞》第六章第1节的内容。是学生学习了细胞这一最基本的生命系统的物质组成、结构和功能后，进一步学习细胞的产生的过程。本节内容在整个高中生物知识体系中具有重要地位，和其他章节有着紧密的联系：一方面，它是对第一章中的“细胞通过分裂产生新细胞”这一结论的具体说明，另一方面，它是学生今后学习减数分裂、遗传规律、生物的变异等内容的基础。本节涉及内容较多，含实验在内共需3个课时组织教学，在此笔者仅针对第一课时的内容进行说课。
2教学目标分析
（1）知识方面：a.了解真核细胞增殖的方式及意义；b.理解细胞增殖的周期性；c.概述植物细胞有丝分裂的具体过程。
（2）能力方面：模拟探究染色体的变化规律，构建染色体、核DNA数量变化的数学模型。
（3）情感、态度与价值观方面：通过对有丝分裂过程的学习，感受生命的运动性，树立唯物主义世界观。
3重点及难点分析
（1）重点：a.真核细胞有丝分裂细胞周期的概念；b.高等植物细胞有丝分裂的过程。
（2）难点：真核细胞有丝分裂过程中，染色体、核DNA的变化规律。
4教法和学法分析
4.1学情分析
从生物学基础来看，学生已经知道了细胞通过分裂产生新细胞，但还仅仅停留在结论水平上，未提及具体过程。通过前五章的学习，了解到了细胞的结构及功能，这为本节内容的学习奠定了良好的知识基础。
从心理学角度来看，高一学生意义识记开始占主要地位，抽象逻辑思维正处于发展成熟中。这些使得学生具备了学习本节内容的能力。
另外，笔者授课的对象是省级示范中学的学生，基础较好。
4.2教法和学法
总体来说，高一学生认知水平的发展还不够完善，而本节内容较抽象，学生又没有直接的生活经验，因此，我采用直观教学法、模拟探究法进行教学。
在本课直观教学法主要是在教学中利用多媒体课件演示有丝分裂的过程，化静为动，化抽象为形象，帮助学生建立感性认识。
模拟探究法则主要是让学生自己动手制作模型，并在此基础上引导学生观察、思考、讨论、交流，最后形成结论。
学法则采用学案导读法、合作探究法。即利用学案引导学生阅读教材，明确学习目标，初步了解本课内容。在突破教学难点时，让学生分组合作、自主探究，尝试发现染色体和DNA的变化规律，从而增强学生分析问题和解决问题的能力。
5教学过程分析
5.1创设情境
上课之前，先播放一段种子萌发及幼苗生长的视频，然后提出问题，植物由一粒种子萌发生长成为完整的植株，这是由于细胞体积增大还是细胞数目增多呢？新细胞是如何产生的呢？引起学生思考，导入新课。
5.2自主学习
学生对照学案阅读教材，根据自身情况选择独立或者合作完成基础知识梳理。这一步骤旨在让学生对本课的重难点内容形成大体的轮廓。
5.3重点解析
真核细胞有丝分裂的细胞周期概念是本节课的重点内容之一。细胞周期的概念本身并不难，只是学生常常忽视其中的一些关键语句从而导致对细胞周期的概念理解不够透彻。讲解时强调要理解这一概念，应注意三个方面：即具备细胞周期的前提条件、细胞周期起始点和终止点。接着引导学生对这一概念进行拓展应用：将细胞周期的概念转换为两种不同的图形，请学生分析两图中分裂间期、分裂期、一个完整的细胞周期的表示方法，这样既可以培养对图形的识别能力，又能加深对细胞周期概念的理解。
高等植物细胞有丝分裂的具体过程是本课的重中之重。在以往的教学中，学生反映该过程抽象、微观，难以理解；过程中涉及的概念较多，对染色质、染色体、姐妹染色单体之间以及细胞板和赤道板之间容易混淆。教学中为重点解决好这两个问题，笔者采用了以下方案：
首先利用flas演示植物细胞有丝分裂的完整过程，形成初步印象；再分期进行演示，同时与学生一道归纳总结各个时期的特点，并以顺口溜的形式介绍给学生，方便记忆。从动画中，学生可以直观、生动地了解植物细胞的有丝分裂过程，将教材上静止的图片还原为细胞分裂的动态变化，让学生感受细胞分裂过程的连续性、动态性，有利于形成较深刻的感性认识。
演示动画的同时，提示学生仔细观察染色体的形态变化，然后结合黑板简笔画，对染色质、染色体、姐妹染色单体这一组概念进行对比分析；通过对比中期、末期细胞图像，结合教材内容，说明赤道板只是一个虚拟的平面，而细胞板是一种具体的物质结构。这样完成对两组易错易混淆概念的辨析。
5.4疑难探究
有丝分裂过程中最难理解的内容莫过于染色体的形态变化及染色体、DNA的数量变化规律了，为突破这一难点，笔者设计了疑难探究环节。
首先学生以小组为单位分三步进行探究：
（1）模拟探究染色体的形态变化：要求学生以一条染色体的变化为例，制作各时期的染色体模型。模型制作完成后要求学生按正确的顺序摆放。
（2）利用第一步中制作的模型，探究含有2N条染色体的细胞进行有丝分裂时，各时期的染色体、DNA的数量，并将探究的结果填写在学案中的表格里。
（3）根据表格中的数据，总结染色体、DNA的数量变化规律，绘制有丝分裂过程中染色体、DNA的数量变化曲线。
小组探究结束后，进行成果汇报。（展示一部分学生制作的染色体模型及绘制的染色体、DNA含量变化曲线图）从照片中可以发现，有些小组的探究结果中还存在或多或少的错误，因此可以先让各小组之间进行交流，相互评价、修改。然后教师从中选择具有代表性的成果进行分析、讨论，最后形成正确的结论。
到此本课时讲授部分全部结束，重点和难点内容也得到了较好的解决和突破。
复习回顾：讲授结束后，结合板书对本课的重点内容植物细胞有丝分裂的过程进行复习回顾，帮助学生形成较为系统的知识网络。
巩固提高：为进一步加深学生对本课重点和难点内容的理解和记忆，笔者设置了与细胞周期、DNA含量变化、植物细胞分裂过程有关的三道习题进行练习，以达到巩固提高的目的。
6教学评价分析
方法：选取我院收治的87例急性药物性间质性肾炎患者作为研究对象，将患者随即分成观察组（45例）和对照组（42例），观察组使用促红细胞生成素联合甲泼尼龙冲击进行治疗，对照组行甲泼尼龙冲击治疗。治疗后观察两组患者的治疗情况以及少尿期、多尿期、蛋白尿和血尿症状消失时间和肾功能恢复正常时间。
结果：观察组45例患者中病情完全缓解的有41例，比例为91.1%，对照组病情完全缓解23例，比例为54.8%，两组患者对比具有明显的统计学意义（P
结论：促红细胞生成素联合甲泼尼龙冲击治疗急性药物性间质性肾炎具有良好的效果，应该在临床中予以大力推广。
关键词：急性药物性间质性肾炎促红细胞生成素甲泼尼龙
【中图分类号】R4【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2013）11-0268-02
急性药物性间质性肾炎（DAIN）是临床上常见的肾脏损害病症，其致病机制是由于患者长期大量使用抗生素、非甾体类抗炎药、利尿药等药物进而引发非免疫介导间质性损伤[1]。该病如果早期发现基本上都能得到有效的治疗，但是如果延误了治疗时机很有可能造成恶性肾功能损害[2]。本院运用促红细胞生成素联合甲泼尼龙冲击对急性药物性间质性肾炎患者进行了治疗，具体内容如下。
1资料与方法
1.1一般资料。本文选取我院于2007年3月至2010年3月收治的87例急性药物性间质性肾炎患者作为研究对象，所有患者均无肾病既往史，经入院后检查均确诊为DAIN。致病原因为：抗生素药物51例，质子泵抑制剂药物11例，非甾体药物9例，中药9例，混合药物5例，不明药物所致2例。尿常规检查结果：蛋白尿73例，血尿61例，白细胞尿86例；血肌酐检查176～1228μmol/L。将87例患者随机分为观察组45例和对照组42例，两组患者在性别、年龄、病程、致病药物、家庭支持等方面均无显著差异（P>0.05）。
1.2一般方法。患者入院后检测致病药物，即时停服该药物，维持电解质平衡[3]。对照组给予500mg/次甲泼尼龙静脉滴注，1d/次，连续滴注三天。后口服0.5mg/kg/d泼尼松，25d为一个疗程；观察组在对照组治疗的基础上运用促红细胞生成素进行联合治疗，加注3000U皮下注射促红细胞生成素，1周3次，持续25天。
1.3统计学方法。应用SPSS16.0统计学软件对上述治疗进行数据的分析，计量资料采用均数±标准差表示，进行t检验，计数资料进行X2检验，P
2结果
治疗后，观察组患者的少尿期、多尿期、蛋白尿和血尿消失时间以及肾功能恢复时间各项指标均优于对照组，经统计学分析两组患者四项指标对比均具有统计学意义（P
3结论
急性药物性间质性肾炎是在短期内发病的肾间质炎症，其临床特征较为明显，一般表现为间质水肿和肾小管受损，有的患者还会伴有肾功能不全等症状。大多数的急性药物性间质性肾炎在停止服用致病药物后能够有一定程度缓解，经过及时的诊断治疗多数可以治愈。如果得不到有效的治疗或者再次服用致病药物有可能产生变态反应进而发展成严重肾衰竭，因此早期发现及时治疗是降低该病危害的重要措施。通过本次研究可以发现，促红细胞生成素联合甲泼尼龙冲击对于治疗急性药物性间质性肾炎具有良好的效果，值得在临床中进行推广。
参考文献
[1]吴昱，苏涛，杨莉等.几种尿标志物在急性药物性肾小管间质性肾炎鉴别诊断中的意义[J].北京大学学报（医学版），2010（02）：164-168
【摘要】
为了研究多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stemcellfactor，SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31；MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能；MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常；MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论：MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。
【关键词】间充质干细胞;多发性骨髓瘤;细胞因子
BiologicalPropertiesofMesenchymalStemCellsDerivedfromBoneMarrowofPatientswithMultipleMyeloma
AbstractThestudywaspurposedtoexploretheroleofmesenchymalstemcells(MSCs)inthepathogenesisofbonediseaseparticularlyobservedinmultiplemyeloma(MM)，thebiologicalfeaturesofmarrowderivedMSCsfrompatientswithMMhavebeeninvestigated.Marrowaspirateswereharvestedfrom11newlydiagnosedpatientswithMMand5normaladultsandMSCswereisolatedandculture-expandedbythecellpropertiesofadherencetoplasticflasks，Thephenotypewasanalyzedbyflowcytometrictechnique.TheproliferationofMSCswasobservedbyMTTassayandtheirdifferentiationcapacitiesintoosteoblastsandadipoblastswereassessedwithlineage-specifichistochemicalstaining.TheconcentrationsofIL-6andSCFintheculturesupernatantweredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).MSCculturesupernatantswerecollectedandMTTassaywasperformedtoevaluatetheirsupportontheproliferationofanMMcelllineSKO007cells.Theresultsshowedthatbonemarrow-derivedMSCsfromMMpatientswerehomogenouslypositiveforCD29，CD73，CD166andHLA-ABCandnegativeforhematopoieticcellmarkerCD45andendothelialcellmarkerCD31，thephenotypeofwhichwassimilartothatofmarrowcounterpartsfromnormaladults.MTTassayindicatedthatMSCsfromMMpatientsornormaladultsproliferatedatsimilarrates.MSCsfromMMpatientsoccupiedinvitroosteogenicandadipogeniccapacityasthosefromnormaladults.ThelevelsofIL-6andSCFinculturesupernatantweregreatlyup-regulatedinMMpatientsbyELISAassay.Furthermore，MSCculturesupernatantsfromMMbonemarrowdisplayedenhancedactivitytopromotetheproliferationofSKO007cells.Itisconcludedthatmarrow-derivedMSCsfrombonemarrowofMMpatientsarenormalintheirproliferationanddifferentiationcapacities，andmyelomabonediseasemaynotbeascribedtothedifferentiationofMSCswhiletheelevatedsecretionofIL-6andSCFmayprovidenecessarycuesforthesurvivalofmalignantmyelomacells.
Keywordsmesenchymalstemcell;multiplemyeloma;cytokine
多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）患者呈现特征性的骨质破坏。这种骨质损伤与破骨细胞数量增加，成骨细胞数减少，从而导致骨吸收与成骨之间失平衡有关［1］。间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）是存在于骨髓的结缔组织干细胞，不但可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化，而且是骨髓基质细胞的前体细胞［2］。骨髓基质细胞为骨髓瘤细胞提供了必需的生存和增殖支持，并由此促进破骨细胞的增殖分化，导致溶骨性损伤［3］；而骨髓瘤细胞可通过细胞因子分泌和(或)细胞间的直接接触，引起成骨细胞的凋亡［4］。但是，以上这些病理改变是否涉及MSC本身，抑或MSC的某些改变促进了疾病进程尚不清楚。为此，我们对骨髓瘤MSC的特性进行了研究。
材料和方法
材料来源
11例MM均为初治患者，男7例，女4例，平均年龄59.4岁;IgG型6例，IgA型3例，κ轻链型2例。对照骨髓来源于骨髓象和血象检查正常的健康人，共5例，其中男3例，女2例，平均年龄51.7岁。SKO007MM细胞株为本研究所传代的细胞株。
骨髓MSC的分离和培养
按参考文献［2］的方法，取肝素抗凝的骨髓，α-MEM稀释2倍后Percoll梯度密度离心收获单个核细胞。将细胞接种于含10%人骨髓MSC专用培养血清的α-MEM中（血清为StemCells公司产品），培养48小时后去除非贴壁细胞，继续培养至贴壁细胞约80%融合，收集培养上清于-70℃冻存备用。0.05%胰蛋白酶消化传代培养。第3代细胞用于以下实验。
细胞免疫表型分析
胰蛋白酶消化收集MSC，加入FITC或PE标志的小鼠源抗人CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166、HLA-ABC和HLA-DR单克隆抗体（eBioscience公司产品），室温下避光反应30分钟。用PBS洗涤2次后，FACSCalibur(BectonDickinson，USA)收集细胞参数，用流式细胞仪检测，WinMDI2.9软件分析结果。
增殖能力的MTT法测定
收集MSC，按750个细胞/孔接种于含MSC完全培养液的96孔培养板中，每组6孔；将SKO007细胞按1000/孔接种于不含血清的RPMI1640培养液的96孔培养板中，培养体系中分别加入10%、20%和40%的MSC培养上清，每组4孔。细胞培养72小时后加入10μlMTT（1g/L），继续培养4小时。离心去除培养液，加入二甲亚砜裂解细胞，以未加MTT孔为本底，570nm波长下测定OD值。
多系分化的鉴定
成骨分化将细胞按5×104/孔接种于6孔培养板，或1×104/孔接种于24孔培养板中，加入地塞米松（10-7mol/L）、维生素C（50mg/L）和β-磷酸甘油（10μmol/L），培养12天，期间换液2次。应用白细胞ALP染色试剂（Sigma公司产品）进行碱性磷酸酶原位染色。
成脂肪分化将细胞按2×104/孔接种于24孔培养板中，次日加入地塞米松（10-6mol/L）、IBMX（0.5mmol/L）和消炎痛（10μmol/L），连续培养7天后去除培养基，用PBS洗涤2次后多聚甲醛室温固定1小时，1%油红O染色，光学显微镜下观察。
MSC的细胞因子分泌功能测定
消化传代细胞培养至贴壁层致密时，更换无血清的α-MEM，培养48小时后收集培养上清，于-70℃冻存备用。按照试剂盒（Bio-Rad产品）操作说明，应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）测定，依据由重组人白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stemcellfactor，SCF）（Peprotech产品）所作的标准曲线，测定培养上清IL-6和SCF浓度。
统计学处理
试验数据以平均值±标准差（±SD）表示，以t检验进行数据分析，P值
结果
MM患者与正常人骨髓MSC免疫表型的比较
体外培养的MM患者和正常人骨髓MSC均一地表达间充质细胞标志CD73和CD166，表达黏附分子CD29，不表达造血细胞标志CD45和内皮细胞标志CD31。此外，细胞表达HLA-I类分子(HLA-ABC)，不表达HLA-DRII类分子。MM骨髓MSC表型与正常人来源MSC相似，MM患者骨髓MSC表型无改变（图1）。
MM患者骨髓MSC增殖能力分析
利用MTT法检测第3代细胞增殖速率。MM患者骨髓MSC与正常人骨髓MSC组比较没有显著差异，OD值分别为0.46±0.11与0.39±0.08(P>0.10)，MM患者骨髓MSC增殖能力正常（图2）。
MM患者与正常人骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力比较
MM患者和正常人骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，细胞形态均发生了明显的变化，部分细胞由纺锤形转变为多边形或不规则形状；12天后经NBT-BCIP染色显示细胞碱性磷酸酶（ALP）活性，MM患者骨髓与正常人骨髓组细胞显色强度比较无明显差别（图3A、B），显示MM患者骨髓MSC成骨能力并没有减低。应用成脂肪诱导体系作用7天，油红O染色显示两组细胞体外成脂肪性能未见明显差别，MM患者骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力正常（图3C、D）。
MM患者与正常人骨髓MSC的IL-6和SCF表达量比较
1×106MM患者骨髓MSC细胞48小时分泌的IL-6总量显著高于正常人骨髓MSC，分别为(9.36±2.11)ng和(4.72±1.64)ng（P
MSC培养上清对SKO007细胞的增殖支持作用
将SKO007细胞用无血清体系培养，加入不同浓度的MSC培养上清，72小时后MTT法测定细胞活力。结果表明：未加条件培养液组大部分细胞死亡；加入10%和20%条件培养液后，两组细胞增殖能力无差别；浓度升至40%时，MM患者骨髓MSC培养上清明显促进SKO007细胞增殖，两组比较差异有统计学意义（P
讨论
MM是B细胞克隆性疾病，肿瘤细胞刺激骨吸收，促进血管形成，导致溶骨性骨损伤，即使化疗成功实施后，骨损伤仍然存在，提示骨髓中成骨细胞的干细胞—MSC可能存在本质的异常。MSC是存在于骨髓的结缔组织干细胞，是骨髓基质细胞的前体细胞。骨髓基质细胞与骨髓瘤细胞相互影响，促进破骨细胞的增殖分化和成骨细胞凋亡。为此，我们分离培养了初治MM骨髓MSC，并与来自年龄相近正常人骨髓的MSC比较，观察MM患者骨髓MSC是否存在生物学特性的异常。结果表明，体外培养的这两种来源MSC表型一致，均不表达造血细胞和内皮细胞的标志，提示MM血管形成可能与MSC向内皮细胞的分化无关。MM患者骨髓MSC不表达HLA-DR，提示MM病人骨髓微环境中炎性因子或相关的调控因素使MSC维系了固有的表型。MSC具有很强的体外增殖和多向分化能力。MM病人骨髓中成骨细胞数量减少［4］，可能与MM骨髓MSC的增殖分化能力有关。本研究采用MTT法检测MSC细胞增殖速率，结果显示MM骨髓源MSC增殖能力与正常骨髓源MSC比较没有显著差异，提示MM病人的MSC增殖能力正常。在体外，MM骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，具有正常的体外成骨能力，且与正常人骨髓MSC相似;MSC体外成脂肪能力与正常骨髓MSC亦相当。本研究表明，MM病人MSC体外增殖分化能力维持在正常水平，骨髓瘤细胞没有改变MSC固有的自我更新和多向分化能力。然而研究已发现，骨髓瘤细胞与成骨细胞系共培养后成骨细胞株Runx-2基因表达下调，从而抑制成骨细胞向骨细胞分化成熟［5-7］。因此，骨髓瘤骨疾病涉及的病理改变可能发生于成骨细胞阶段，而与MSC分化能力无关。研究已经表明，MSC和骨髓基质细胞可分泌G-CSF、GM-CSF、VEGF、SCF及IL-6等多种细胞因子［3，8，9］，这些因子相互影响，形成网络调节骨髓瘤细胞的生物学特性［10］，促进骨髓瘤细胞增殖和存活。人骨髓瘤细胞也表达成骨细胞特异性转录因子Runx2，并分泌骨桥蛋白（osteopontin，OPN）［7］。研究发现OPN也与胃癌的侵袭转移有关［11］。骨髓基质细胞分泌IL-6等细胞因子，促进骨髓瘤细胞分泌与成骨发育相关的因子，以抑制成骨新生，促进骨溶性损伤［3，12］。骨髓瘤细胞是骨髓中碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）的主要来源。bFGF促进骨髓组织新生血管形成、刺激基质细胞分泌IL-6［13］。人骨髓MSC也表达bFGF受体。骨髓瘤病人MSC细胞分泌异常可能与体内异常细胞因子网络调节有关。本研究发现，在体外，MM患者骨髓MSC分泌的IL-6和SCF量明显高于正常人骨髓MSC，而细胞培养上清促进骨髓瘤细胞SKO007增殖。MM患者骨髓MSC表型和增殖分化功能与正常MSC相当，这提示骨髓MSC在MM病人体内受到骨髓瘤细胞的直接刺激作用后，高表达IL-6和SCF，并以旁分泌的形式维系瘤细胞的恶性表征，从而间接影响成骨和骨吸收过程，这可能是骨髓瘤并发骨疾病的原因之一。
总之，多发性骨髓瘤病人骨髓MSC生物学性状与正常骨髓MSC比较无明显变化，而其高表达IL-6与SCF可能与骨髓瘤细胞的直接作用有关。本实验研究了骨髓瘤MSC的表型、增殖分化、功能等特征，其结果为MM骨损伤的发生机制及其干预治疗等的研究提供了重要信息。
【参考文献】
1Barille-NionS，BatailleR.Newinsightsinmyeloma-inducedosteo-lysis.LeukLymphoma，2003;44:1463-1467
2GuoZ，YangJ，LiuX，etal.Biologicalfeaturesofmesenchymalstemcellsfromhumanbonemarrow.ChinMedJ（Engl），2001;114:950-953
3RoodmanGD.Roleofthebonemarrowmicroenvironmentinmultiplemyeloma.JBoneMinerRes，2002;17:1921-1925
4SilvestrisF，CafforioP，CalvaniN，etal.Impariedosteoblastogenesisinmyelomalbonedisease:roleofupregulatedapoptossisbycytokinesandmalignantplasmacells.BrJHaematol，2004;126:475-486
5GiulianiN，CollaS，SalaR，etal.Humanmyelomacellsstimulatethereceptoractivatorofnuclearfactor-kappaBligand(RANKL)inTlymphocytes:apotentialroleinmultiplemyelomabonedisease.Blood，2002;100:4615-4621
6GiulianiN，CollaS，MorandiF，etal.MyelomacellsblockRUNX2/CBFA1activityinhumanbonemarrowosteoblastprogenitorsandinhibitosteoblastformationanddifferentiation.Blood，2005;106:2472-2483
7CollaS，MorandiF，LazzarettiM，etal.HumanmyelomacellsexpresstheboneregulatinggeneRunx2/Cbfa1andproduceosteopontinthatisinvolvedinangiogenesisinmultiplemyelomapatients.Leukemia，2005;19:2166-2176
8TocciA，ForteL.Mesenchymalstemcell:useandperspectives.HematolJ，2003;4:92-96
9林如峰，陆化，刘澎等.蛋白酶体抑制剂PS-341对多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞多种细胞因子表达的影响.中国实验血液学杂志，2006；14：61-64.
10LautaVM.Areviewofthecytokinenetworkinmultiplemyeloma:diagnostic，prognostic，andtherapeuticimplications.Cancer，2003;97:2440-2452
11张东涛，袁静，杨力等.骨桥蛋白在胃癌中的表达及与胃癌侵袭转移的关系.中华肿瘤杂志，2005;27:167-169
12KaradagA，ScuttAM，CroucherPI.Humanmyelomacellspromotetherecruitmentofosteoblastsprecursors:mediationbyinterleukin-6andsolubleinterleukin-6receptor.JBoneMinerRes，2000;15:1935-1943
【摘要】
目的观察黄芩苷对肝癌HepG-2细胞增殖的影响。方法采用MTT比色法观察黄芩苷抑制肝癌HepG-2细胞增殖；采用流式细胞仪检测黄芩苷对HepG-2细胞周期分布的影响。结果黄芩苷可抑制肝癌HepG-2细胞增殖，其作用具有时间和浓度依赖性；黄芩苷可诱导细胞凋亡，同时改变细胞周期分布，多数细胞阻滞于S期，与对照组比较，细胞凋亡率差异有显著性。结论黄芩苷可诱导肝癌HepG-2细胞凋亡，改变细胞周期分布，从而抑制细胞增殖。
【关键词】黄芩苷细胞周期细胞凋亡
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheinhibitionofbaicalinonproliferationhepatomaHepG-2cells.MethodsMTTassaywasusedtoexaminetheeffectofbaicalinontheproliferationofHepG-2cellandflowcytometrywasusedforthecellcycledistribution.ResultsBaicalininhibitedtheproliferationofHepG-2cellandtheeffectswereinatime-and-concentrationdependentmanner.Baicalincouldalsoinduceapoptosis，theSphasewasarrestedandtheratioofapoptosistherewassignificantdifferencethanthatofcontrolgroup，respectively.ConclusionBaicalininhibitsproliferationofHepG-2cellsviainductionofapoptosisandcellcyclearrest.
Keywords:Baicalin;Cellcycle;Apoptosis
黄芩为唇形科(Labiatae)植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，是常用中药。性寒、味苦，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。黄芩的主要成分是黄酮和黄酮醇、二氢黄酮和二氢黄酮醇、苯乙醇糖苷、挥发油以及葡萄糖、蔗糖、苯甲酸、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和苯甲醇等。其中，属于黄酮类化合物的黄芩苷(Baicalin)作为黄芩的最主要有效成分，在黄芩根中含量为9%~14%。近年来，随着对黄芩苷的深入研究，发现黄芩苷具有抗菌、抗病毒、抗感染、抗HIV、抗氧化及清除氧自由基和治疗心血管疾病等作用。本实验选用肝癌HepG-2细胞株作为研究对象，研究黄芩苷对肝癌HepG-2细胞增殖的作用以及黄芩苷对细胞周期分布和凋亡的影响。
1材料与仪器
1.1细胞株HepG-2细胞购于南京凯基生物技术公司。
1.2药物试剂黄芩苷购于南京青泽医药有限公司。噻唑兰购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；小牛血清购自北京华美生物工程公司；胰蛋白酶购自美国DIFCO公司；鼠抗bcl-2、p53单克隆抗体购自福州迈新生物有限公司。
1.3仪器OLYMPUS倒置显微镜购自日本；RT-2100型酶标仪购自美国；FACSCalibur流式细胞仪购自美国；JEM-1200EX透射电子显微镜购自日本；PD-2000真彩色病理细胞图像分析仪购自北京天地百年科技公司。
2方法
2.1HepG-2细胞培养肝癌HepG-2细胞贴壁生长，培养于含10%灭活小牛血清，含100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、相对湿度90%、5%CO2孵箱内培养。
2.2HepG-2细胞形态的变化取对数生长期HepG-2细胞按每瓶1×105个细胞接种于96孔细胞培养板中，24h后换液，加入含不同浓度（25，50，100μg/ml）黄芩苷的10%新生小牛血清RPMI1640培养液200μl，另设终浓度为25μg/ml5-Fu的阳性对照组和不加药物的阴性对照组。置5%CO2孵箱内培养24，48，72h。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状态，48h时进行常规HE染色。
2.3MTT比色实验取对数生长期的HepG-2细胞按每孔1×105个细胞接种于96孔板中，每孔体积200μl。24h后换液，黄芩苷组加入黄芩苷使其终浓度分别为25，50，100μg/ml，另设终浓度为25μg/ml的5-Fu阳性对照组和不加药物的阴性对照组以及不接种细胞的空白对照组。分别培养24，48，72h，每个浓度每个时点均设4个复孔。于终止前4h，每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，继续孵育4h后弃去上清液，加入150μlDMSO，轻轻振荡10min，使结晶物完全溶解，于490nm波长处在荧光酶联分析仪上测光吸收值(A值)，计算抑制率(IR)。
IR(%)=(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值×100%
2.4流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布对照组和50μg/ml黄芩苷组细胞培养48h后，收集各组细胞悬液1ml，浓度约为106个/ml，离心（1000r/min，5min），弃掉培养液，70%冷乙醇固定，4℃PI暗染30min，流式细胞仪检测，采用ModfitLT3.0软件对各组样本进行DNA含量及细胞周期分析。
2.5统计方法应用SPSS11.5统计软件进行相关性分析和方差分析，数据采用±s表示。
3结果
3.1对HepG-2细胞生长的影响
3.1.1细胞生长形态变化对照组HepG-2细胞呈上皮型贴壁生长，细胞呈延展、扁平，细胞均质而透明，细胞一般有2~4个核仁，核膜、核仁轮廓明显，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛。黄芩苷组、阳性对照组细胞轮廓增强、反差增大，变圆浮起，细胞间接触变松，增殖减慢，胞质中颗粒增多；HE染色染色质浓缩，呈深染的新月体形，可见凋亡小体。
3.1.2MTT比色实验不同浓度处理组分别培养24，48h，黄芩苷对HepG-2细胞生长有抑制作用，且其抑制作用具有时间和浓度依赖性。随着时间的延长和药物浓度的增加，细胞抑制效果越明显，药物对肿瘤细胞生长有量-效、时-效关系。当黄芩苷浓度为50μg/ml作用时间为48h时，对HepG-2细胞的抑制率为51.241%，接近半数抑制浓度(IC50)。结果见表1~2。
表1黄芩苷对HepG-2细胞生长的影响（略）
表2黄芩苷对HepG-2细胞生长抑制率（略）
与同剂量组比较，*P
3.2黄芩苷对HepG-2细胞DNA含量的影响50μg/ml黄芩苷作用于HepG-2细胞48h后，经流式细胞仪检测（图1）可以看出加药组细胞出现明显的细胞凋亡峰，其凋亡率为27.01%，与对照组细胞的凋亡率5.47%相比差异有显著性（P＜0.01）。结果见表3。
图1黄芩苷对HepG-2细胞DNA含量的影响(FCM)（略）
3.3黄芩苷对HepG-2细胞周期的作用经流式细胞仪分析，50μg/ml黄芩苷处理HepG-2细胞48h后，在G0/G1期、G2/M和S期的细胞分别为56.49%，11.02%和32.49%；而未经药物作用的对照组细胞的G0/G1期为54.79%、G2/M期为22.11%、S期为23.10%。可见黄芩苷作用下，G2/M期细胞明显减少，而S期细胞比率显著上升，多数细胞阻滞在S期。结果见表3。
表3黄芩苷对HepG-2细胞周期的影响（略）
与对照组比较，*P
4讨论
细胞凋亡普遍存在于大多数肿瘤组织细胞中，与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系［1］。现已明确，大多数抗肿瘤药物都能诱导敏感肿瘤细胞发生凋亡，并且其抗肿瘤效能与肿瘤细胞在药物诱导下发生细胞凋亡的内在活性有关［2］。因此，通过观察是否能诱导肿瘤细胞凋亡已成为寻找抗肿瘤药物的新靶点，也是评价疗效的一项新指标［3］。本实验中MTT结果显示黄芩苷对HepG-2细胞的增殖具有明显的抑制作用。其细胞生长抑制随着药物浓度的升高和时间的延长而增加，具有量-效、时-效关系。流式细胞术结果说明黄芩苷可以诱导肝癌HepG-2细胞凋亡。同时，黄芩苷能明显抑制HepG-2细胞的周期变化，使其阻滞细胞停止于S期，使细胞周期改变而诱导细胞凋亡。关于黄芩苷诱导细胞凋亡的详细作用机制有待于进一步研究。
参考文献
［1］黄韧敏，袁淑兰.丹参酮ⅡA诱导HL-60细胞凋亡［J］.癌症，1998，17(3)：164.
【关键词】T细胞激活剂，；Jurkat细胞；重组激活基因；逆转录聚合酶链反应
【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectsofTcellactivatorsonthemRNAexpressionofrecombinationactivatinggenes(RAGs)inJurkatcells.METHODS:AfterJurkatcellsweretreatedwithPHA(20mg/L)，antiCD3mAb(1∶100)，PMA(40μg/L)+A23187(0.5μmol/L)for6and12hrespectively，RAG1andRAG2mRNAweremeasuredbyRTPCR.SemiquantitativeanalysiswasusedtoevaluateRAG1andRAG2mRNAlevelsindifferentgroups.RESULTS:Comparedwiththecontrolgroups，thelevelsofRAG1mRNAweresignificantlylowerindifferenttreatedgroups(P
【Keywords】Tcellactivators;Jurkatcells;recombinationactivatinggenes;reversetranscriptasepolymerasechainreaction
【摘要】目的：研究T细胞激活剂PHA，抗CD3mAb，PMA+A23187对人T细胞白血病细胞株Jurkat重组激活基因（RAGs）mRNA表达水平的影响.方法：采用RTPCR法检测不同T细胞激活剂作用不同时间后Jurkat细胞中RAG1，RAG2mRNA，以β肌动蛋白（βactin）的表达作为内参照进行灰度分析，比较不同组Jurkat细胞RAGsmRNA的表达水平.结果：三种T细胞激活剂刺激诱导的Jurkat细胞RAG1mRNA表达量明显低于对照组（P
【关键词】T细胞激活剂；Jurkat细胞；重组激活基因；逆转录聚合酶链反应
淋巴细胞特异性重组激活基因（recombinationactivatinggenes，RAG）1和RAG2是参与V(D)J重排和功能性抗原受体基因形成的一个首要条件［1］.一般认为，RAG1，RAG2基因仅特异性地同时表达于淋巴细胞发育的早期阶段，而不表达于淋巴细胞分化发育的较成熟阶段.然而，近年的研究发现，外周成熟淋巴细胞中也有RAGs表达和V(D)J重排的发生［2-3］.迄今，外周淋巴细胞RAGsmRNA的表达和调节机制仍不清楚.本研究以代表T细胞发育成熟阶段的人T细胞白血病细胞株Jurkat细胞为研究对象，检测其RAG1和RAG2mRNA的共表达情况，探讨T细胞激活剂对Jurkat细胞RAGsmRNA表达水平的影响，为研究外周T细胞的RAGs表达调节机制奠定基础.
1材料和方法
1.1材料Jurkat细胞株购自上海细胞生物研究所（cloneE61，ATCCNumberTIB152，TCRαβ+CD3+CD4+CD8CD2+CD7+).分泌抗CD3mAb的杂交瘤细胞株12F6由南方医科大学分子免疫学研究所冻存.RPIM1640培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA广东医药工业研究所产品）；佛波醇12豆蔻酰13乙酸酯（Phorbol12Myristate13Acetate，PMA），钙离子载体A23187（美国Sigma公司）；总RNA提取试剂盒（安徽优晶生物工程有限公司）；RNA逆转录试剂盒（日本TOYOBO公司）；TaqDNA聚合酶（立陶宛MBIFermentas公司）；pUCmT载体（上海生工生物工程技术服务有限公司）；DL2000DNAMarker（TaKaRa大连宝生物有限公司）.
1.2方法
1.2.1细胞培养、处理及总RNA提取Jurkat细胞用含有100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃，50mL/LCO2条件下培养.将对数生长期的Jurkat细胞，按1×109/L的密度培养于12孔板中，分别加入PHA（20mg/L），抗CD3mAb（1∶100），PMA（40μg/L）+A23187（0.5μmol/L），同时设不加任何处理因素的对照组，每组均设3个复孔，分别在培养的第6，12h，收集各组细胞，PBS洗涤2~3次后采用试剂盒提取细胞总RNA，在核酸蛋白分析仪（BECKMANDU530）上鉴定RNA纯度和浓度，-70℃冻存备用.
1.2.2RNA逆转录取样品总RNA约1μg，加到20μL反应体系中按试剂盒说明进行逆转录.
1.2.3PCR扩增RAG1，RAG2mRNAPCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成.RAG1上下游引物序列分别为：5′GAGCAAGGTACCTCAGCCAG3′，5′GAGGCATCTGAGAATGCAG3′，扩增片段长度为984bp，PCR反应条件为94℃2min；94℃30s，58℃45s，72℃1min，30个循环；RAG2上下游引物序列分别为：5′ATACCTGGTTTAGCGGCAAA3′，5′CCAGCCTTTTTGTCCAAAGAA3′，扩增片段长度为192bp，反应条件为94℃2min；94℃15s，60℃20s，72℃45s，30个循环；βactin上下游引物序列分别为：5′ACATTAAGGAGAAGCTGTGC3′，5′CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT3′，扩增片段长度375bp.βactin与RAG1或RAG2在同一反应体系中扩增.PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后采用凝胶成像系统（BIORADGelDoxXRsystem）照相.
1.2.4PCR产物的克隆和序列分析切胶回收并纯化PCR目的产物条带，将之与pUCmT载体连接后转化DH5α感受态菌，采用α互补实验挑选阳性克隆进行测序，DNA序列测定由大连宝生物工程有限公司完成.
1.2.5RTPCR产物半定量分析将PCR产物电泳条带用全自动图像分析系统（德国KONTRONIBAS2.0）分析，测出每一条带的面积（AREA）乘以平均光密度（meanopticaldensityoftheobject，OPTDM），得出结合光密度（integratedopticaldensityoftheobject，OPTDI)，根据RAG1和RAG2与βactinOPTDI的比值计算目的基因的相对表达量来进行半定量分析.
统计学处理：所得数据用x±s表示，应用SPSS10.0统计软件对数据进行方差分析（OnewayANOVA）和LSDt检验，P
2结果
2.1Jurkat细胞RAG1，RAG2mRNA的表达在Jurkat细胞中同时检测到RAG1和RAG2mRNA表达（图1）.
1:RAG1;
2:RAG2;M:核酸分子量标准DL2000.
图1Jurkat细胞RAG1和RAG2mRNA表达
2.2T细胞激活剂对Jurkat细胞RAGsmRNA表达的影响对照6，12h组细胞RAG1，RAG2mRNA表达量无显著性变化，而三种T细胞激活剂刺激诱导后RAG1mRNA表达量明显低于对照组（P
3讨论
本实验发现，代表T细胞发育成熟阶段的Jurkat细胞同时表达RAG1和RAG2mRNA，RTPCR产物测序结果表明与GeneBank报道序列完全一致.Jurkat细胞经T细胞激活剂诱导后RAGs表达水平发生变化.结果提示Jurkat细胞有发生TCR重排的可能，且其RAGs的表达可能经TCR信号传导通路调节.进一步证实：已经具有功能性抗原受体的淋巴细胞也可表达RAGs，即在某些情形下TCR的存在并不足以中止RAGs的表达.
A:RAG1与βactin;B:RAG2与βactin.1，3，5，7:分别是PHA，抗CD3mAb，PMA+A23187和对照6h组;2，4，6，8:分别是相应各12h组;M:核酸分子量标准DL2000.
图2不同处理因素对RAG1，RAG2mRNA作用的RTPCR产物电泳图
在体外用抗CD3抗体作用于小鼠胸腺皮质双阳性细胞引起TCRCD3复合体交联，或用PMA和钙离子载体处理小鼠胸腺皮质细胞和未成熟preT细胞株CCRFCEM后导致RAG1和RAG2表达下调，且PMA引起的RAGs表达下调作用更为迅速而显著［4-5］.我们以PHA，PMA+A23187作用于成熟T细胞株Jurkat后RAGs基因表达亦呈下调趋势，尤以PMA+A23187作用最为明显.但抗CD3mAb作用组Jurkat细胞RAG1表达下调，而RAG2表达增加，与中枢或未成熟前T细胞株诱导后的变化有所不同，可能反映了中枢T细胞和前T细胞与外周T细胞在RAGs表达调节机制上的不同，有可能RAG2更多地参与了Jurkat细胞TCRCD3复合体的信号传导过程.
RAGs的表达和调节是一个高度复杂而有序的过程，RAG蛋白的正确时空特异性表达对获得性免疫系统的正常发育至关重要.经典的免疫学理论认为，T细胞迁出胸腺后不再表达RAGs和发生重排.但近年的研究表明，经重排形成的TCR在特定条件下还可发生再次重排，使其原有的抗原特异性改变或发生亲和力的变化，这种现象被称为受体编辑/修正［6-8］.外周T淋巴细胞RAGs的表达调节和V(D)J重排机制与自身免疫病、肿瘤和免疫缺陷等疾病关系的研究已成为热点，国外一些实验室主要利用转基因动物模型技术进行研究.基于本实验结果以及Jurkat细胞是代表T细胞发育成熟阶段的单克隆细胞株的特点，我们考虑可利用Jurkat细胞株建立一个研究外周成熟T淋巴细胞RAGs的表达调节和V(D)J重排的细胞模型，可弥补转基因动物模型研究成本和技术要求高等不足之处，便于我们在现有实验条件下开展此方面的研究.
【参考文献】
［1］RaulM，FrederickWA.ReceptorrevisioninTcell:anopenquestion［J］?TRENDSImmunol，2004，25:276-279.
［2］LantelmeE，MantovaniS，PalermoB，etal.IncreasedfrequencyofRAGexpression，CD4+CD3lowperipheralTlymphocytesinpatientswithdefectiveresponsestoDNAdamage［J］.EurJImmunol，2000，30:1520-1525.
［3］LantelmeE，PalermoB，GranzieroL，etal.RAGgeneexpressionandV(D)JrecombinationinCD4+CD3lowmatureTlymphocytes［J］.JImmunol，2000，164:3455-3459.
［4］LaurenceA，Turka，SchatzDG，etal.ThymocyteexpressionofRAG1andRAG2:TerminationbyTcellReceptorCrosslinking［J］.Science，1991，253:778-781.
［5］GeoffreyAM，ThomasJ，RakeshMG，etal.ExpressionoftheV(D)JrecombinasegeneRAG1istightlyregulatedandinvolvesbothtranscriptionalandposttranscriptionalcontrols［J］.MolImmunol，1992，29:1457-1466.
［6］王小宁.受体编辑/修正免疫识别与耐受的新模式［J］.第二军医大学学报，2002，23(10):1071-1073.
［7］CooperCJ，OrrMT，McMahanCJ，etal.Tcellreceptorrevisiondoesnotsolelytargetrecentthymicemigrants［J］.JImmunol，2003，171:226-333.
目前，在发育生物学研究中，线虫（Caenorhabditiselegans）是一种主要的模式动物，其发育细胞数目少且细胞谱系恒定。在这里，本文作者希望通过对线虫发育模式的了解和探究来大致阐述线虫适于进行遗传分析的原因及相关的思考与启发
关键词线虫；发育；遗传分析
中图分类号Q95文献标识码A文章编号1674-6708（2013）102-0145-02
1胚胎的发育过程
1.1胚胎发育和胚后发育
线虫的卵较小，受精后形成极体。在雌雄原核融合前有一次可能无效的卵裂，但雌雄原核融合后真正意义的卵裂就开始了。第一次卵裂是不对称的，产生一个大的位于前端的AB细胞和一个小的位于后端的P1细胞。在第二次卵裂中，AB细胞分裂产生前端的ABa细胞和后端的Abp细胞。同时P1细胞分裂产生靠后端的P2细胞和靠前端的EMS细胞。此时，AB细胞进一步分裂主要发育为皮下组织、神经细胞和肌肉组织。同时，EMS细胞分裂成E细胞和MS细胞。前者发育成肠，后者发育成肌肉、腺体和神经细胞。P2分裂成P3细胞和C细胞。后者行成肌肉、皮下组织和神经细胞，前者分裂成P4细胞和D细胞。D细胞发育成肌肉，而P4细胞发育成生殖细胞。原肠胚形成开始于28细胞期，此时E细胞后代向内移动。整个发育过程中，某些特定细胞发生程序性死亡，因此并非胚胎发育过程中形成的所有细胞都能存活。新孵化的幼虫在整体上与成体相似，但还未达到性成熟，缺少性腺及其附属结构。c成虫中的附加细胞大部分来自P细胞（前体胚细胞），它们沿体轴分布。每种P细胞通过1-8次细胞分裂建立一个不变的细胞谱系。（细胞谱系是指从第一次卵裂起到最终发育成组织和器官细胞为止的发育史图示。）综上，线虫的胚后发育过程就象是在幼虫基本方案基础上增加一些成虫结构而已。
1.2关于线虫胚胎发育、胚后发育模式与动物遗传分析研究关系的思索与启发
1.2.1有丝分裂
卵裂的过程中细胞都是以有丝分裂方式进行增殖。由于胚胎透明，细胞数目有限，因此通过活体观察或染色等方式研究有丝分裂的过程及其相应遗传物质的变化就会显得可行。事实上，借助Novmaski显微镜，其发育的细胞谱系已经建立。因此，对于该生物发育过程中有丝分裂时遗传物质的变化与操作程序的研究已经是较为成熟的了。
1.2.2细胞分化
线虫胚胎在第一次不对称卵裂后就产生了有各自特定发育方向的细胞，说明其细胞的分化虽然还没正式开始，但其准备工作已经就绪。也就是说，其基因的选择性表达从卵裂一开始就已体现出来。而由于卵裂开始时其具有特定发育方向的细胞各自的数目都不多，加上胚胎呈透明色，通过该细胞的遗传物质研究来分析细胞分化时遗传物质的动向和操作机制将会显得更加典型和方便。所以说，从卵裂阶段开始追踪其细胞的遗传特点或许能进一步了解生物在发育期间细胞分化的遗传机理及其作用。另外，在各细胞的发育方向中，有不止一种细胞的发育方向为神经组织、皮下组织和肌肉组织。可见，该数种组织为各器官所必备的营养或支持组织，而其发生起源于该器官源细胞的周边细胞。这也有助于启发对生物发育过程中某些器官周围的器官或组织的源细胞的定位与研究。事实上，通过把分子中带有不扩散高分子葡萄糖的荧光染料注入创立者细胞，幼虫中每个部位细胞的家族史立时昭然若揭。在科学家们的努力下，该生物基因组中3000个基因已有约800得到了定位，其中某些种类的基因组已经被全部确定。同时，该生物从受精卵到成体一千多个细胞发育过程中的每一次细胞分裂都已被描述，其中与生殖系统、神经系统、运动系统等组织器官的发育与分化过程有关的基因多已被定位。结合生物分子学方法，一些基因开启、部位已经确定。人们渴望从中得到更为详细的关于各个基因在发育过程中何时表达、何部位表达和为什么能表达的信息，从而最终揭示生命发育过程的有序性和严格规定性。
1.2.3细胞凋亡
胚胎发育过程中出现的细胞程序性死亡说明该程序贯穿动物体整个生命历程，而其死亡基因也是从一开始就被某种机制启动了的。同时，蜕皮现象也能说明细胞程序性死亡的存在与意义。其死亡意义可能是因为该细胞已经衰老，也可能是其存在已对生命体继续发育构成了阻碍，从而不得不被清除。由于细胞总数有限，加上成体细胞数目恒定，细胞的凋亡过程也会相对明显。因此，通过对线虫胚胎细胞程序性死亡机理与过程的研究，同时通过对该过程中遗传物质动向的追踪，我们就能更好的了解遗传物质在细胞凋亡时起到的作用及其相应的操作基理。事实上，随着对凋亡好奇心的增长，人们越来越渴望了解细胞形态学变化背后的深层机制。恰当其时的，兴起于1960年代的分子生物学经过20年的发展，已经能为人们解决凋亡的分子医学问题提供足够的技术支持。到了1972年，由西德尼·布雷纳（SydneyBrenner）开创的以线虫为材料的研究道路为揭示凋亡的分子机制提供了一个绝佳视角。而约翰·萨尔斯顿（JohnSulston）一手建立的线虫细胞谱系为嗣后罗伯特·霍维茨（RobertHorvitz）等人进行的凋亡基因研究提供了坚实基础。到1986年，有关线虫发育中凋亡的基因调控机制已经得到基本阐明。以线虫为起点，许多与人类细胞凋亡调控和癌症发生有密切关系的基因也陆续被发现。而发育生物学和医学中诸多领域的观念结构也随着凋亡及其相关机制研究的进展发生了根本改变。由于线虫研究开创了一个对今日生物医学发展具有举足轻重的全新领域，同时也因为以线虫为基础的凋亡研究对基础和应用生物学产生的巨大推动作用，2002年11月，卡罗林斯卡医学院的诺贝尔奖评选委员会将本年生理和医学奖授予了西德尼·布雷纳、约翰·萨尔斯顿和罗伯特·霍维茨。
2成虫
2.1成虫的繁殖生育模式
线虫为雌雄异体，雄性较小。有少数为雌雄同体，更有一些只有雌体而无雄体，营孤雌生殖。还有一些虽有雄体，可仍出现孤雌生殖现象。线虫的生殖器官为细长管状，雌雄异体的种类中，雄性分化出了单个的精巢、输精管、储精囊、管，直肠为泄殖腔，为泄殖孔；雌性分化出成对的卵巢、输卵管、子宫及两条子宫汇合成的阴道，腹侧中线上有生殖孔。雌雄，子宫内受精。雌雄同体的物种则有两个卵巢、输卵管、藏精器及单一子宫。寄生种类产卵量巨大。
2.2关于对成虫繁殖生育模式与动物遗传分析研究关系的思索与启发
容易培养和保存，生活周期短，杂交实验操作简便，受环境影响因素小，遗传分析性状明显，变异一般可在显微镜下进行观察等优点使得线虫（以秀丽隐杆线虫为例）得以成为较为优良的杂交实验材料。事实上，线虫作为遗传实验材料最大的优点在于它具有自体异体两种能力。这一特性与两种性别的虫体在形态上的易分性给遗传分析带来了极大的方便。通过杂交，很容易引入各种遗传标记。比如要得到带有隐性的杂合子雄虫，只需挑选纯显雄虫和纯隐两性虫杂交，后代所得雄虫即为所需品种，因为只有异交才有雄虫的增殖。而通过自交，很容易得到隐性突变纯合子。观察杂合子两性虫自交后代的表型分离，很容易体现孟德尔的几个遗传定律。同时，各类突变体可用作多项遗传实验的材料，而以线虫为材料做基因克隆等分子生物学实验也是简便易行的。可见，成体线虫由于其特殊的模式与较快的繁育速度成为了比较理想的研究和分析基因遗传定律的模式材料。
3实际案例
以下是部分利用线虫模式生物来研究生物遗传方面问题的实例：
1）细胞程序性死亡的遗传调控机制；
2）RNAi及其作用机制（与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象）；
3）秀丽线虫的功能基因组学及其它研究。
综上所述，线虫作为经典的模式生物，其本身是十分适合于各种与动物遗传分析相关的研究的。从发育过程中的细胞增殖、分化、凋亡，到成体成熟后的生殖，线虫都能在与遗传分析方面有关的科学研究中起到模式生物的作用。
其实，有关模式生物本身的研究一直在进行，而对线虫的研究也从来没有停滞过。全世界的线虫研究者始终坚持材料、资源、信息和数据的无偿共享，使这一领域的研究得以飞速发展。随着越来越多的研究者的加入，我们坚信秀丽线虫的研究必将继续为人类探索生命规律的调控机制做出更大贡献。
参考文献
[1]许崇任.动物生物学.高等教育出版社.
[2]李云龙，刘春巧.动物发育生物学.山东省泰山科技专著出版基金会资助出版.
[3]刘凌云，郑光美.普通动物学.3版.高等教育出版社.
[4]任淑仙.无脊椎动物学（上册）.北京大学出版社.
[5]普通动物学.2版.高等教育出版社.
[6]王盛献.推荐一种遗传学教学实验用新材料——秀丽隐杆线虫.
[7]冯亮，廖翔华.线虫发育模式的分子生物学研究概况.
[8]模式生物基础知识介绍有奖征集.
[9].cn.小线虫.大发现.
关键词：肺癌；A549细胞：MRC-5细胞；细胞生长；哌啶并噻吩：结构活性关系
中图分类号：Q279
文献标识码：A
文章编号：1007-7847（2014）05-0382-05
肺癌是世界范围内发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一。近年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性肺癌发病率和死亡率占女性所有恶性肿瘤的第二位[1]。肺癌的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、综合治疗等，药物治疗及靶向治疗在其中占据了重要的地位[2]。目前，临床上常用的治疗肺癌的药物有贝伐单抗、西妥昔单抗、长春新碱等，虽然这些药物对肺癌有一定的疗效，但也存在着很大的毒副作用及机体对药物的极大的耐药性问题，因此，开发疗效显著、靶向性强、毒剐作用小的新型治疗药物显得尤为重要[3]。
化学合成的有机小分子是一种相对分子质量小、容易进入细胞、可以与其中的蛋白质分子结合并影响蛋白活性的一种化合物。在抗肿瘤药物的筛选中，这种小分子化合物也得到广泛的应用，筛选有活性的小分子化合物是其中的第一步。一口.筛选到活性化合物，该化合物就被视为可能的药物先导化合物，后续可进行结构修饰、药理学研究、药代动力学分析等药物开发的相关研究工作。、此外，就算筛到的活性化合物不适合作为药物开发对象，进一步寻找该化合物的作用靶点及作用机制，电可发现一些与肿瘤发生发展相关的重要的新的基因，从而为药物研发提供新的靶点，因此也是具有重要意义的[4，5]。在20世纪八九十年代，快速合成结构多样的有机小分子的技术发腱成熟，随后商业化的小分子化合物大量出现，为抗肿瘤药物筛选及肿瘤发生机制的研究提供了丰富的资源[6]。
在医药的研究发展过程中，含氮杂环化合物因其具有独特的生物活性、低毒性等，常被作为医药创制的基本结构单元[7-9]1。为了寻找高活性的新型化合物，本研究从实验室现有的小分子化合物库中选取13个含有哌啶并噻吩为母核，成氯盐，目前国内外文献未见报道的新型化合物，在体外培养肺癌A549细胞中，研究其对细胞生长的抑制作用；并分析了化合物结构与活性之问可能存在的关系。对活性最高（对A549细胞生长的抑制率最高）的化合物进行了抑制A549细胞生长的浓度依赖效应分析及对正常人胚肺成纤维MRC-5细胞的生长抑制作用研究。
1材料与方法
1.1材料
人肺癌细胞系A549由昆明理工大学医学院张继红老师馈赠，正常人胚肺成纤维细胞系MRC-5购自中国科学院昆明动物研究所细胞胞库，小分子化合物购自LifeChemicals。研究中所用主要试剂包括：改良型RPMI-1640培养荩fIIv一clone）、DMEM培养基（Hyclone）、胎牛血清（Scien―Cell）、特级胎牛血清（Gibco）、青链霉素混合液液（So一larbio）、胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）、二甲基亚砜（DMSO，Solarbio）。WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）。
1.2细胞培养
从液氮罐中取出细胞，复苏后置于6cm直径的细胞培养皿中，放在37℃、5%C02条件下的细胞培养箱（Thermo）中培养。A549细胞完个培养基包括改良型RPMI-1640培养基、10%的胎牛血清（ScienCell）、1%的青链霉素混合液；MRC-5细胞完全培养基包括DMEM培养基、15%的特级胎牛血清（Gibco）、1%的青链霉素混合液。复苏后生长状况良好的细胞，传代至10cm直径的细胞培养皿中扩大培养，以备后续试验使用。选取生长状态良好处于对数生长期的细胞接种于96孔板，用于小分子化合物活性检测试验。
1.3.13个小分子化合物对A549细胞生长的抑制作用分析
将处于对数生长期的A549细脆，接种于96孔板，铺板密度为2xl04cells/mL，即每孔为2000个细胞，体积为100μL。细胞接种24h后，向其中分别加入各小分子化合物（终浓度为10μmol/L）体积为1μL，对照孔中加入等体积的DMSO（终浓度为0.5%），每个处理设3个重复（每个小分子及DMSO均分别处理3个孔的细胞），再补加细胞完全培养基100μL。小分子化合物处理48h后，每孔加入WST-1溶液20μL，在培养箱内继续孵育2～4h，然后用酶标仪在450nm波长处测定吸光值，所得数据用于结果分析。1.4小分子化合物11抑制A549细胞生长的浓度依赖效应分析及对MRC-5细胞生长的抑制作用分析
将处于对数生长期的A549细胞和MRC一5细胞，接种于96孔板，铺板密度为2x104cells/mL，即每孔为2000个细胞，体积为100μL。细胞接种24h后，向其中分别加入不同浓度的化合物11（噻吩并[2，3-c]哌啶-3-甲酰胺一2一[（3一甲氧基一萘-2-羰基）一氨基卜6-苄基一，盐酸盐；Thieno[2，3-c]piperidine一3-carboxamide-2-[（3-methoxy-naphthalene-2-carbonyl）-amino]-6-（benzyl）-，hy-drochloride）（终浓度分别为1、2.5、5、10μmol/L），体积为1μL，对照孔中加入等体积的DMSO（终浓度为0.5%），每个处理设3个重复（不同浓度的小分子及DMSO均分别处理3个孔的细胞），再补加细胞完全培养基100μL。小分子化合物处理48h后，每孔加入WST-1溶液20μL，在培养箱内继续孵育2～4h，然后用酶标仪在450nm波长处测定吸光值，所得数据用于结果分析。该化合物抑制A549细胞生长的IC50值用GraphPadPrism软件计算。
2结果与分析
2.113个小分子化合物对A549细胞生长的抑制作用
本研究所用的13个化合物是具有相同核心结构（图1）的类似物，并成氯盐。因其核心结构含哌啶并噻吩结构，所以我们暂时把这一类小分子命名为哌啶并噻吩类化合物。核心结构中的R1、R2代表不同的结构基团。化合物1～4的Rl结构基团为甲氧羰基，5―8的R1结构基团为氰基，9～13的R1结构基团为氨甲酰基（表1）。
用化合物（终浓度10μmol/L）处理A549细胞48h后，用WST-1法检测细胞的存活情况，通过与对照细胞（DMSO）的存活情况进行比较，来计算各化合物对A549细胞生长的抑制率（表1）。R1结构基团均为甲氧羰基的化合物中，对A549细胞生长的抑制率最高的是化合物4，抑制率为（26.58+3.65）%；R1结构基团均为氰基的化合物中，对A549细胞生长的抑制率最高的是化合物7，抑制率为（46.59+8.68）%；R1结构基团均为氨甲酰基的化合物中，对A549细胞生长的抑制率最高的是化合物11，抑制率为（71.34+0.96）%。2.2小分子化合物11抑制A549细胞生长的剂量效应及对MRC-5细胞生长的抑制作用
13个小分子化合物中对A549细胞生长抑制率最高的化合物11，我们又进行了不同浓度的化合物11对A549细胞和MRC-5细胞生长的抑制作用分析。结果显示，该化合物对A549细胞生长的抑制作用具有明显的浓度依赖效应，A549细胞的存活率随化合物11浓度的增加而逐渐降低，在终浓度为10μmol/L的时候，抑制率达到最大。用GraphPadPrism软件计算出该化合物抑制A549细胞生长的1C50为2.407μmol/l.。虽然MRC-5细胞的存活率也随化合物11浓度的增加而有所降低，但终浓度为10μmol/L时，其对MRC-5细胞生长的抑制率也只有30.41%（图2）。
由此可见，化合物11对A549细胞生长的抑制作用是一种特异的作用，而非简单的细胞毒性，同时该化合物对MRC-5细胞生长的抑制率远小于对A549细胞生长的抑制率，这些特征都暗示我们该化合物或许可作为治疗肺癌药物先导化合物来进行药物研发。
3讨论
A549细胞系是1972年由GJiard等从58岁的白种男性的肺腺癌组织移植，通过体外培养建立的细胞系，一方面具有Ⅱ型肺泡上皮细胞的形态及特性，另一方面表现出典型的肺腺癌细胞恶性特征。因此，A549细胞系被广泛用于抗肺癌药物筛选及其他肺癌相关研究中。
本研究中，检测细胞存活情况采用的是WST-1法。WST-1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点，具有快速、简便、准确等特点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的甲瓒（formazan）不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的甲瓒都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤；其次，WST一1产生的甲瓒比XTT和MTS产生的甲瓒更易溶解；再次，WST-1比XTT和MTS更加稳定，使试验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT'、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高；是体外筛选抗癌新药的可靠方法。
含氮杂环母核的化合物一直是研究的热点，但目前哌啶并噻吩类化合物研究相对较少，只有曾国平等报道9个合成的未见报道的新型哌啶并噻吩并嘧酮衍生物中，部分化合物有较好的抑制黄瓜灰霉、水稻纹枯、小麦赤霉菌生长的活性，本研究所筛选的化合物是13个未见报道的哌啶并噻吩类化合物.在体外培养A549细胞，利用W-ST-1法检测化合物处理后细胞存活率的变化，发现了部分化合物能不同程度抑制A549细胞生长，其中化合物II对A549细胞生长的抑制效率最高，但对正常MRC-5细胞牛长的抑制作用显著低于对A549细胞生长的抑制作用，这一新的发现也为肺癌治疗药物的开发提供了新的思路。
通过对13个小分子化合物结构与活性之间可能存在的关系进行分析，发现Rl结构基团为甲氧羰基的4个化合物中，化合物4的活性最高，化合物1、2、3活性相对较低的原因可能是R2结构基团相对大.导致空间阻力大，使得与受体结合不够强：Rl结构基团为氰基的4个化合物中，化合物5、6、7的活性差不多，其中化合物5、6可能因为R2结构基团有苯并杂环结构，化合物7需要待一步研究；R1结构基团为氨甲酰基的4个化合物中，化合物Il的活性最高，可能因为其R2结构基团有苯并结构及苯环结构的完整性。化合物结构与活性之问关系的初步分析也为以后的化合物结构优化设计及计算机辅助药物筛选提供了一定的思路。
【摘要】目的:研究放射性核素碘(131I)标记表皮生长因子受体单克隆抗体(McAb)1H12的实验条件，观察标记产物131I1H12与人肺癌细胞A549的免疫结合及生物学效应。方法:131I以Iodogen法标记1H12，经体外细胞结合试验分析检测标记抗体的免疫活性;通过流式细胞仪检测不同剂量131I1H12(148、74、37kBq)、游离131I(148kBq)及1H12(80nmol·ml-1)对A549细胞的作用。结果:131I1H12标记率为50.14%，比活度为4.63MBq·μg-1，放射性浓度为77.31MBq·ml-1，放射性化学纯度为96.92%。131I1H12与A549细胞结合率为61.12%;131I1H12诱导A549细胞凋亡和周期阻滞呈剂量效应关系，以148kBq131I1H12作用效应最大，凋亡率达到(44.35±3.31)%，G2/M期细胞阻滞率达(51.17±2.98)%。结论:131I1H12能够与A549细胞发生免疫结合，并调控细胞周期和诱导细胞凋亡。
【关键词】非小细胞肺癌;表皮生长因子;放射免疫治疗;131I;单克隆抗体
[Abstract]Objective:Toinvestigatetheexperimentalconditionsofradionuclideiodine(131I)labelingepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)monoclonalantibody(McAb)1H12，observethecellbindingfunctionandbiologicaleffectsof131I1H12tohumanlungcancercellsA549.Methods:1H12waslabeledwith131IbyIodogenmethod.Theimmunocompetenceof131I1H12wasanalyzedbycellbindingtest.ThecellapoptosisandcellcyclesofA549wereanalyzedbyflowcytometryassaywithvariousdosesof131I1H12(148，74，37kBq)，free131I(148kBq)，1H12(80nmol·ml-1)andequivalentmedium.Results:Thelabelingrateof131I1H12was50.14%，itsspecificactivity，radioactiveconcentrationandradiochemicalpuritywere4.63MBq·μg-1，77.31MBq·ml-1and96.92%respectively.Thespecificbindingrateof131I1H12toA549cellswas61.12%;TheapoptosisrateandcycleblockagerateofA549cellsinducedby131I1H12wereinadoseeffectrelationship;Thesupremeapoptosisrate[(44.35±3.31)%]andG2/Mcellcycleblockagerate[(51.17±2.98)%]werefoundintheA549cellstreatedwith148kBq131I1H12.Conclusion:131I1H12canimmunobindwithA549cellsandregulatecellcycleandinduceapoptosisofA549cellstoinhibititsproliferation;Itmighthavesomepotentialapplicationprospectinbiologicaltargeteddiagnosisandtherapeutics.
[Keywords]nonsmallcelllungcancer;epidermalgrowthfactor;radioimmunotherapy;131I;monoclonalantibody
表皮生长因子受体(EGFR)在非小细胞肺癌的治疗中已成为一个重要的靶点，目前针对EGFR的肺癌靶向治疗药物(易瑞沙、特洛凯等)早已进入临床应用[1-2]。为研究应用抗EGFR抗体进行非小细胞肺癌放射免疫显像及治疗的可能性，本实验通过放射性碘标记EGFR单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)1H12，探讨了131I1H12与人肺癌细胞A549在体外结合情况及其生物学效应。
1材料与方法
1.1A549细胞
人非小细胞肺癌A549细胞系22代，购于中国科学院上海细胞生物研究所。
1.2主要仪器
FH463A自动定标器(西安二六二厂核仪器分厂);RM905a活度计(中国计量科学研究所);HERACellCO2培养箱(美国Kendro公司);Eppendorfcenhifuge低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司);YJ875超净工作台(苏州苏净净化设备有限公司);流式细胞仪：FACSVantageSE型。
1.3主要试剂
鼠抗人EGFRMcAb(1H12)：美国CST公司产品，纯度>98%。Na131I溶液:中国核动设计院第一研究所(无还原剂、无载体)产品。Iodogen(四氯二苯基甘脲)：美国Sigma公司产品。葡聚糖凝胶G50(SephadexG50):瑞典AmershamBiosciences公司产品。细胞培养液RPMI1640培养液:Gibcobrl公司产品。胎牛血清(FCS):杭州四季青生物工程材料有限公司产品。
1.4131I1H12的标记与鉴定[3]
(1)标记前准备：将Iodogen溶解于二氯甲烷中制成浓度为1μg·μl-1的Iodogen溶液，取100μl加入乙烯Eppendorf管中，氮气吹干后在试管底部内壁形成一层均匀的Iodogen膜，制备完成后保存于4℃备用。(2)Iodogen法131I标记1H12：在涂布Iodogen的Eppendorf管中依次加入0.5mol·L-1、pH7.6的磷酸盐缓冲液50μl，1H1225.0μg(pH7.6PBS溶解，浓度1μg·μl-1)，Na131I46.25MBq，充分混匀后在室温下反应10min，其间温和振荡数次。(3)分离纯化反应：将反应液滴加于预先经PBS(0.01mol·L-1、pH7.4)平衡、2%牛血清白蛋白封闭饱和的SephadexG50层析柱上，用0.01mol·L-1、pH7.4的PBS洗脱层析柱，自动收集器收集部分洗脱液，流速每管1.0ml·min-1，共收集20管，按收集时间顺序排列各管;RM905放射性活度计测定各管的活度，以Rf为横坐标，对应各管的放射性活度为纵坐标，制作时间放射性活度洗脱曲线。(4)放射化学纯度(radiochemicalpurity，RCP)测定:生理盐水纸层析法测定标记物RCP。(5)计算标记率、放射浓度：标记率=蛋白峰各管放射性活度总和/蛋白峰加游离峰各管放射性活度之和;放射浓度=投入的Na131I总量×标记率/蛋白峰收集的总ml数。(6)比活度的测定：放射性比活度=投入的Na131I总量×标记率/投入的1H12量。(7)131I1H12的体外稳定性，置于室温37℃，于第24小时、48小时、72天测定各自放射化学纯度，评价其体外稳定性。(8)131I1H12收集液过滤除菌备用。
1.5131I1H12对A549细胞株的体外实验
(1)A549细胞EGFR表达率：取对数生长期细胞，调整细胞浓度至106ml-1，用-20℃预冷的80ml·L-1乙醇固定过夜，流式细胞测定EGFR的表达率。(2)131I1H12免疫活性的鉴定：常规培养的肺癌细胞株(A549)、脐静脉血管内皮细胞，用RPMI1640完全培养液制备细胞悬液调至细胞浓度1×106ml-1，两种细胞分别装入6孔培养板使细胞浓度在1×106细胞·(1.0ml)-1·孔-1(足量)，每组细胞中分别加入131I1H12(105cpm)，摇匀，常规培养12h，每2h振荡1次，培养12h后将每孔的上清液移入试管，0.25ml胰蛋白酶消化A549细胞与脐静脉血管内皮细胞，将细胞移入装有相应上清液的试管。在FH463A自动定标器上测定每孔的总放射性。1000r·min-1离心5min，去上清液。沉淀用PBS洗涤3次，最后测沉淀物放射性。按如下公式计算体外细胞结合率：体外细胞结合率(%)=沉淀部分放射性计数(cpm)/总放射性计数(cpm)×100%[4]。(3)药物实验分组：将24瓶对数生长期A549细胞分成A～F6组，每组4瓶，A、B、C组分别加入131I1H12148、74、37kBq，D组加入Na131I溶液148kBq，E组加入1H1280nmol·L-1，F组加入等量培养液[5]。(4)检测131I1H12对细胞的生物学作用：给药后的各组细胞用小铅砖分隔培养12h后换液(普通培养液)，继续分隔培养36h。显微镜下观察细胞形态，收集细胞以调整浓度至106ml-1，用-20℃预冷的80ml·L-1乙醇固定过夜，并用以AnnexinⅤFIFC/PI双染法测定药物对细胞的早期诱导凋亡作用，采用DNA倍体分析法检测细胞周期[4，6]。
1.6统计学处理
数据用均数±标准差表示，SPSS13.0软件处理，采用方差分析;两两比较采用LSD法。
2结果
2.1EGFRMcAb131I1H12的标记及鉴定
Iodogen法碘化标记McAb(1H12)，经SephadexG50柱层析分离游离碘和EGFRMcAb131I1H12，从洗脱曲线上(图1)可见：131I1H12蛋白峰出现在第3、4、5管;游离碘峰出现在第10、11、12管。标记产物进行纸层析，根据公式计算其标记率为50.14%，比活度为4.63MBq·μg-1，其放射浓度为77.31MBq·ml-1，生理盐水纸层析法测定放射性化学纯度为96.92%。24、48、72h我们测得的放射性化学纯度依次为95.33%、94.79%和91.03%，说明标记产物在体外具有较好稳定性。
2.2标记抗体131I1H12的免疫活性
标记抗体经体外细胞结合分析显示131I1H12与A549细胞体外结合率达61.12%，而与人脐静脉血管内皮细胞不发生特异性体外结合，其结合率仅为7.16%，和前者比差异具有统计学意义(P
2.3131I1H12对A549细胞的生物学作用
流式细胞仪测得A549细胞的EGFR表达率为75%。光镜下细胞形态改变[7]：倒置显微镜下见A、B、C组A549细胞不同程度变圆，胞体皱缩，细胞轮廓渐趋模糊，形态异常。有的细胞结构松散，细胞质粗糙，颗粒明显增多，出现堆积现象，多数细胞脱壁，漂浮于培养液中。而F组细胞未见有上述现象，细胞生长旺盛，有很多分裂相(图2)。流式细胞术分析各组细胞的细胞周期及凋亡(表1)：通过亚G1峰检测其凋亡率分别为A组(44.35±3.31)%、B组(16.29±2.76)%、C组(9.36±2.32)%、D组(8.03±1.38)%、E组(1.51±0.79)%、F组(1.44±0.34)%，各组与F组比较，细胞凋亡率有统计学差异，A、B、C组的凋亡率随放射性浓度增加而升高。细胞周期阻滞亦随药物剂量增加而升高，从(33.84±1.92)%升高至(51.17±2.98)%，呈明显剂量效应关系(图3、4)。A组与D组比较存在统计学差异，说明发挥肿瘤杀伤作用的是与细胞结合的131I1H12。
3讨论
鼠抗人EGFRMcAb(1H12)系免疫球蛋白IgG，分子质量为17.5kDa，本实验以Iodogen法对1H12进行131I标记，标记率为50.14%，放化纯度>95%，在体外稳定性良好。抗体的同位素标记技术中最重要的是要保持抗体尤其是McAb的生物、免疫学活性，否则即使标记工作做得再好也无法将标记抗体应用于下一步的实验或临床领域。我们实验结果证实抗EGFRMcAb(1H12)经碘化标记以后保持原有的免疫学活性，131I1H12能与肺癌A549细胞发生特异性结合。
已有研究表明，细胞周期的阻滞与细胞凋亡、分化密切相关，细胞通过2个限制点(G0/S期和G2/M期限制点)保证细胞的复制[8]。细胞受损时，通过激活限制点分别导致细胞的G0期或G2期延迟，使细胞有时间完成复制前和有丝分裂前的修复，以保证细胞存活;当损伤超过细胞的修复能力时，则促使细胞凋亡。为探讨131I1H12对A549细胞的生物学效应，我们使用流式细胞术对各组A549细胞的细胞凋亡情况及细胞周期的变化进行了观察。实验结果表明，给药48h后A、B、C组A549细胞随着药物放射性活度增强，G0/G1期细胞逐渐减少，G2/M期细胞明显增多，呈明显剂量效应关系。凋亡率也由(9.36±2.32)%升至(44.35±3.31)%，说明A549细胞抑制作用可能与G2/M期阻滞有关。C组与D组的凋亡率无统计学差异(P>0.05)，说明小剂量长时间131I1H12与大剂量短时间Na131I对A549细胞的凋亡作用相当。
有研究表明大多数非小细胞肺癌细胞EGFR能够高密度表达和(或)发生突变，而正常人肺组织EGFR表达呈阴性[1]。目前以肺癌EGFR为靶点的肿瘤靶向治疗方法较多，很多靶向药物已经开始应用于临床。我们选用高敏感性鼠抗人EGFRMcAb(1H12)做了放射性碘标记的实验，并探讨了标记后的131I1H12对EGFR表达阳性(75%)的A549细胞的生物学效应，为体内进行非小细胞肺癌EGFR为靶点的放射免疫显像及治疗奠定实验基础[9-10]。与以往单纯的抗肺癌单克隆抗体介导的放射免疫治疗相比[11-12]，131I1H12并不仅仅作为非小细胞肺癌的靶向治疗药，只要是高表达EGFR的肿瘤都能适用，且运用低剂量131I1H12进行肿瘤EGFR的放射免疫显像，可作为其他针对EGFR的靶向治疗初筛条件[2]，从而减少不必要的医疗资源消耗。虽然运用表皮生长因子(EGF)作为核素的载体，同样可以达到对肿瘤的EGFR靶向治疗的效果[13]，考虑到EGF本身作为促进肿瘤生长的因素之一，其作为放射性核素载体在实际的临床应用的安全性仍将受到质疑。综上所述，无论用放射免疫显像进行肿瘤表达EGFR与否的分类和初筛，还是本身作为靶向治疗剂，放射性核素标记EGFR单克隆抗体都具有潜在而可观的应用前景[14-15]。
关于131IEGFRMcAb对体内非小细胞肺癌的相关实验，笔者将在接下来的工作中继续深入研究。相信随着研究的不断深入，必将使非小细胞肺癌的此类靶向诊断及治疗模式逐渐趋于完善。
参考文献
[1]FUKUOKM，YANOS，GIACCONEG，etal.MultiinstitutionalrandomizedphaseⅡtrialofgefinitibforpreviouslytreatedpatientswithadvancednonsmallcelllungcancer[J].ClinOncol，2003，21(12):2237.
[2]MATTESMJ，GOLDENBERGDM.TherapyofhumancarcinomaxenograftswithantibodiestoEGFrandHER2conjugatedtoradionuclidesemittinglowenergyelectrons[J].EurJNuclMedMolImaging，2008，35:12491258.
[3]任均田，李峰.Iodogen法碘标记McAb技术探讨[J].放射免疫学杂志，1996，9(3):145146.
[4]FROIDEVAUXS，EBERLEAN.Somatostatinanalogsandradiopeptidesincancertherapy[J].Biopolymers，2002，66:161183.
[5]孙俊杰，范我，许玉杰，等.125I[Tyt3]octreotide内化及杀伤NCIH446细胞的研究[J].中华核医学杂志，2004，24：144146.
[6]URROWSF，ZHANGH，KAMALA.asp90activationandcellcycleregulation[J].CellCycle，2004，3(12):15301536.
[7]MICHELRB，BRECHBIELMW，MATTESMJ.Acomparisonof4radionuclidesconjugatedtoantibodiesforsinglecellkill[J].NuclMed，2003，44:632640.
[8]OSAKAM，OSHIMURAM，HOH.PI3KAktpathway:itsfunctionsandalterationsinhumancancer[J].Apoptosis，2004，9:667676.
[9]GOLDENBERGDM，DELANDF，KIME，etal.Useofradiolabeledantibodiestocarcinoembryonicantigenforthedetectionandlocalizationofpersecancersbyexternalphotoscanning[J].NEngJMed，1978，298:13841386.
[10]孙晓春，周前.几种抗人肺癌细胞单克隆抗体及其片段放射免疫显像的实验研究[J].中华核医学杂志，1997，17(1)：4648.
[11]葛棣，曾亮，葛锡锐，等.90钇标记单克隆抗体LC1对荷肺癌裸鼠局部放射免疫治疗[J].复旦学报:医学版，2003，30(2)：160163.
[12]刘黎，李少林.131I22F7抗体对荷小细胞肺癌裸鼠体内分布及其对肿瘤的生长抑制作用[J].中华核医学杂志，2006，26(6)：357360.
[13]徐卫云，李云，春何生，等.放射性碘标记表皮生长因子核素靶向治疗乳腺癌的实验研究[J].中华外科杂志，2005，43(1):1417.
一、选择题(2.5×20=50分)
1.若连续分裂的细胞处于一个细胞周期中，则细胞内()
A.处于分裂期时会大量利用T与U
B.DNA复制和转录过程的每个起点都多次起始
C.染色体的数目与DNA分子的数目始终保持相同
D.严格的调控机制保证了细胞周期的有序运行
[答案]D
[解析]连续分裂的细胞分裂方式为有丝分裂，在一个细胞周期中，在分裂期时染色体高度螺旋化，无法进行DNA的复制和蛋白质的合成，故不会大量利用T与U;在一个细胞周期中，DNA只复制一次，DNA复制过程的每个起点只有一次起始，蛋白质可多次合成，转录过程的每个起点可多次起始;当出现染色单体时，DNA分子的数目是染色体的数目的2倍。
2.下列关于动物细胞有丝分裂的叙述正确的是()
A.分裂间期，在细胞核中发生了DNA复制、转录和翻译
B.染色单体形成于分裂前期，消失于分裂后期
C.纺锤体形成于分裂前期，消失于分裂后期
D.分裂后期，染色体和染色体组数都加倍
[答案]D
[解析]分裂间期细胞核进行DNA复制、转录，翻译发生在细胞质的核糖体，故A错。染色体在间期复制，结果1染色体含2条单体，后期随着着丝点分裂，单体分离成为染色体，故B错。纺锤体形成于分裂前期，消失于分裂末期，故C错。分裂后期，由于着丝点分裂，导致染色体和染色体组数都加倍，故D确。
3.下图表示动物细胞有丝分裂时的染色体数(a)，染色单体数(b)和DNA分子数(c)的数量关系。下列解释肯定不正确的是()
A.①可以用于表示细胞分裂的前期
B.①时染色体的螺旋化程度可能达到
C.间期用②表示最恰当
D.③表示细胞分裂完成
[答案]C
[解析]图②中染色体已加倍，且无姐妹染色单体，故可表示为有丝分裂后期。
4.甲图为典型的细胞核及其周围部分结构示意图;乙图为有丝分裂过程中一个细胞核中DNA含量变化曲线，则相关叙述正确的是()
A.假设甲图代表的细胞处在细胞周期中，则甲图代表的细胞相当于乙图的cd段
B.在细胞分裂周期中，既可消失又可重建的结构是甲图中的4、5，其消失时间是乙图的de段
C.在细胞分裂周期中，可重建与消失的结构应为3，其重建时间为0～b或f～h，其余时间消失
D.甲图所示结构不可能代表细菌，但细菌分裂过程中也会出现DNA复制
[答案]D
[解析]若甲图代表的细胞处在细胞周期中，则应代表细胞周期的间期，即相当于乙图中的ab或fg段;在细胞周期中，既可消失又可重建的结构是甲图中的4、5，其消失时间是乙图的bc或gh段;由于甲图具有典型的细胞核，故不可能代表细菌，细菌分裂过程中也会出现DNA复制。
5.高等生物体内时刻都有许多细胞在进行分裂、生长、衰老、凋亡，下列相关的描述错误的是()
A.无丝分裂名称的由来主要原因是分裂过程中无纺锤丝和染色体的出现
B.有丝分裂间期时间大约占细胞周期的90%-95%
C.高度分化的细胞不能再分裂、分化
D.细胞凋亡是由细胞内的遗传物质所控制的
[答案]C
[解析]无丝分裂是因为在分裂过程中不出现染色体和纺锤体，故A正确。有丝分裂的间期占的时间较长大概占90%-95%，故B正确。一般高度分化的细胞不能再进行分裂，但如肝细胞是分化程度较高的细胞但也能进行分裂，有些高度分化的细胞发生癌变后就能无限增殖，故C错误。细胞凋亡是基因控制的程序性死亡，故D正确。
6.下图1表示细胞分裂的不同时期与DNA含量变化的关系;图2表示处于细胞分裂不同时期的细胞图像。下列相关叙述正确的是()
A.处于图1AB段的细胞可能发生基因突变，D点染色体数目与C点相等
B.图2中甲细胞含有4个染色体组，染色体数DNA分子数=11
C.图2中乙、丙细胞处于图1中的BC段，甲细胞处于CD段
D.图2中乙细胞发生基因重组，分裂产生一个卵细胞和一个极体
[答案]B
[解析]甲图处于有丝分裂的后期，染色体组数为4;姐妹染色单体已分开，因此染色体数DNA分子数=11。
7.下列有关人体细胞生命历程的叙述，正确的是()
A.细胞分化形成不同功能的细胞，这些细胞没有相同的蛋白质
B.衰老的细胞内多种酶活性降低，没有基因的表达
C.癌细胞不能进行正常的分化，机体清除癌细胞与细胞凋亡有关
D.细胞的分裂、分化、衰老和坏死对生物体均有积极的意义
[答案]C
[解析]细胞分化形成不同功能的细胞，这些细胞有不同蛋白质，也有相同蛋白质，如生命活动所需的酶(呼吸酶等)，细胞结构蛋白(染色体组分蛋白等)，故A错。衰老的细胞内多种酶活性降低，仍然有细胞代谢，仍然有基因的表达合成蛋白质，故B错。癌细胞由于恶性增殖不能进行正常的分化，机体清除癌细胞与细胞凋亡有关，故C正确。细胞的分裂、分化、衰老对生物体发育、正常生命活动均有积极的意义，而细胞坏死是非正常死亡，对正常生命活动不利，故D错。
8.细胞的分化、衰老和凋亡是普遍存在的现象。下列有关叙述正确的是()
A.细胞膜的通透性改变，使物质运输功能增强
B.细胞的自然更新、被病原体感染的细胞消除，是通过细胞凋亡完成的
C.细胞癌变是细胞不断增殖的结果
D.皮肤色素沉积出现的“老年斑”是细胞分化的结果
[答案]B
[解析]A错，细胞膜通透性改变，物质运输功能降低;C错，细胞癌变是细胞畸形分化的结果;D错，老年斑是细胞衰老的结果。
9.健康是社会关注的焦点，也是人类永恒的主题，下列叙述不正确的是()
A.细胞凋亡能清除体内细胞，影响机体生长发育
B.饮食中摄入过量胆固醇类食物可能会引发心血管疾病
C.良好的心理状态和健康的生活方式可以有效预防癌症的发生
D.细胞通过分化形成各种组织是生物进化的表现
[答案]A
[解析]细胞凋亡是由基因所决定的细胞自动结束生命的过程。细胞凋亡肩负着维持各种组织器官固有体积和形态功能的作用，还会使机体内异常细胞得到及时清除，去除潜在隐患。
10.人类精子发生过程中，下列说法不正确的是()
A.一男性正常情况下产生1种初级精母细胞
B.姐妹染色单体携带的遗传信息可能是不同的
C.染色单体的交叉互换发生在同源染色体分离之前
D.一个精原细胞产生两个相同精子的概率为1/223
[答案]D
[解析]A项中，精原细胞经过染色体复制形成初级精母细胞，一男性正常情况下产生1种初级精母细胞;B项中，减数第一次分裂前的间期发生基因突变，可能使姐妹染色单体携带的遗传信息不同;C项中，染色单体的交叉互换发生在四分体时期，在同源染色体分离之前;D项中，正常情况下，一个精原细胞产生4个精子，两两相同，故产生两个相同精子的概率为100%。
11.如图为同一生物不同分裂时期的细胞示意图，下列说法不正确的是()
A.图①中含有四对同源染色体，不含姐妹染色单体
B.图②中染色体数目等于正常体细胞中染色体数目的一半
C.图③中染色体、染色单体、核DNA的数目之比为12∶2
D.若发生染色体的交叉互换，等位基因的分离也可发生在图④中
[答案]B
[解析]①为有丝分裂后期，有4对同源染色体，A正确;图②为减Ⅰ中期，染色体数目等于正常体细胞中染色体数目，B错;图③为有丝分裂中期，染色体、染色单体、核DNA的数目之比为12∶2，C正确;图④中无同源染色体，为减Ⅱ后期，若发生染色体的交叉互换，等位基因的分离也可发生在图④中，D正确。
12.(2014·新课标Ⅱ，2)同一动物个体的神经细胞与肌细胞在功能上是不同的，造成这种差异的主要原因是()
A.二者所处的细胞周期不同B.二者合成的特定蛋白不同
C.二者所含有的基因组不同D.二者核DNA的复制方式不同
[答案]B
[解析]神经细胞和肌细胞都停留在细胞间期，一般不再进行分裂。二者是由于分化形成的，根本原因是基因的选择性表达，直接原因是二者合成了功能不同的蛋白质。两种细胞来源于同一个体，含有相同的基因组。二者核DNA的复制方式都是半保留复制。解决本类题的关键是要抓住细胞分化的本质。
13.如图表示人体内干细胞的增殖分化。下列有关叙述正确的是()
A.干细胞与白细胞的基因组成不同，但合成的mRNA和蛋白质的种类相同
B.血小板和红细胞核内遗传信息的流动方向是DNADNARNA蛋白质
C.图示所有的细胞中，干细胞具有细胞周期，而且其分裂能力较强
D.白细胞能够穿过血管壁去吞噬病菌，这是因为细胞膜具有选择透过性
[答案]C
[解析]选项A错，干细胞与白细胞的基因组成相同，但合成的mRNA和蛋白质的种类不同;选项B错，人的红细胞没有细胞核;选项C正确，图示中除干细胞外都是高度分化的细胞，失去了分裂的能力;选项D错，白细胞能够穿过血管壁去吞噬病菌，这是因为细胞膜具有流动性。
14.下图表示人体内一些生命活动，下列有关说法正确的是()
A.进行①过程的细胞，不一定具有周期性
B.②过程导致细胞中的遗传物质发生改变
C.③过程总是与机体的衰老同步进行
D.④过程是由于抑癌基因突变成原癌基因
[答案]A
[解析]细胞增殖包括有丝分裂、无丝分裂和减数分裂，只有有丝分裂才具有细胞周期，所以进行①过程的细胞，不一定具有周期性，故A正确;②过程细胞分化是基因选择性表达的结果，但是细胞中的遗传物质并未发生改变，故B错误;③过程细胞衰老不是与机体的衰老同步进行，幼年个体也有细胞衰老，只是老年机体中细胞衰老多一些，故C错误;④过程细胞癌变是由于抑癌基因和原癌基因发生突变导致的，故D错误。
15.下图表示玉米根尖细胞有丝分裂过程中每条染色体中DNA含量变化曲线，下列有关叙述正确的是()
A.玉米根尖所产生的生长素，除了在尖端可以横向运输外，其他部位都是极性运输
B.在BC时期高尔基体会特别活跃，并组建形成细胞板
C.CD时期可发生非等位基因的自由组合
D.导致CD段产生的原因是着丝点分裂，此时期细胞的每一极均含同源染色体
[答案]D
[解析]玉米根尖所产生的生长素，除了在尖端可以横向运输外，其它部位不一定都是极性运输，如在韧皮部可以进行非极性运输，故A错误;在DE时期高尔基体会特别活跃，并组建形成细胞板，故B错误;CD时期表示有丝分裂后期，而非等位基因的自由组合发生在减数第一次分裂后期，故C错误;CD时期表示有丝分裂后期，其细胞核内的主要变化是着丝点分裂，姐妹染色单体分离，分别移向细胞的两极，此时期细胞的每一极均含同源染色体，故D正确。
16.科学家通过研究揭开了胚胎如何由一个细胞发育成完善的特化器官，如脑和腿的遗传秘密，也建立了科学界对动物基因控制早期胚胎发育的模式。这项突破性的成就，将有助于解释人类先天性畸形，这些重要基因的突变很可能是造成人类自然流产以及约40%不明原因畸形的主因。下列有关叙述中，错误的是()
A.生物体的个体发育过程必须有细胞分化的过程
B.卵细胞的分化程度虽没有一般体细胞的高，但其潜在全能性较高
C.生物体的发育过程受基因的控制，遗传物质变化可能导致畸形
D.细胞分化产生的细胞间稳定性的变化一般是不可逆转的
[答案]B
[解析]个体发育离不开细胞分裂和细胞分化。没有分裂，细胞数目就不会增多。没有细胞分化，就不能形成功能多样的不同细胞群。个体发育是在细胞分化的基础上完成的。卵细胞潜在的全能性较高，是由于其细胞质中含有激发细胞分化的物质。但卵细胞是特化的细胞，其分化程度高。细胞分化是基因选择性表达的结果，遗传物质并没有发生改变。当遗传物质发生改变就可导致畸形。细胞分化一般具有不可逆的特点。
17.以下选项正确的是()
[答案]BD
[解析]通过坐标图分析，考查有丝分裂过程中DNA与染色体数目的变化关系、细胞吸水失水与渗透压的关系、生物膜的结构以及细胞分化的有关知识。有丝分裂的过程中，DNA复制以后，新细胞核形成前的各时期，细胞核中DNA与染色体数目比为21;在后期着丝点分离后，至DNA复制以前，核DNA和染色体数目的比为11;在一般情况下，细胞吸水，细胞内渗透压减小，细胞失水，细胞内渗透压增大;图示为物质从细胞内运至细胞外的方式，其特点是依靠膜载体蛋白，消耗能量，为主动运输，不能运输胰蛋白酶，胰蛋白酶的运输方式为胞吐;胚胎干细胞是一种全能干细胞，具有分化为各种组织细胞的潜能。注意，对有丝分裂过程中，染色体数目变化的根本原因是着丝点分裂和细胞分裂，DNA数目变化的原因是复制和细胞分裂，DNA复制发生在细胞分裂间期，着丝点分裂发生在有丝分裂后期或减数第二次分裂后期。
18.某实验室进行下图所示实验研究，下列相关叙述中正确的是()
A.肝细胞、神经细胞、上皮细胞等细胞中基因组成相同，mRNA完全不同
B.与纤维母细
胞相比，经过程a形成的诱导干细胞的全能性较高
C.过程b是诱导干细胞的形态、结构和遗传物质发生稳定性差异的过程
D.上述细胞中具有细胞周期的是诱导干细胞和神经细胞
[答案]B
[解析]肝细胞、神经细胞、上皮细胞等细胞中部分蛋白质如呼吸酶相同，因此部分mRNA相同，故A错误;纤维母细胞是高度分化的细胞，全能性低，而诱导干细胞能分化成多种细胞，故全能性较高，故B正确;过程b为细胞分化，不发生遗传物质的改变，故C错误;神经细胞一般不具有分裂能力，故没有细胞周期，故D错误。
19.2015年4月15日～21日是第21个全国肿瘤防治宣传周。本届宣传周的主题是：“科学抗癌，关爱生命”，副主题是“抗击癌症，从了解开始”下列相关叙述不正确的是()
A.致癌因子使与癌有关的基因缺失，导致细胞癌变
B.癌细胞易侵袭机体周围正常组织，说明癌细胞易发生转移
C.癌症产生疼痛的直接原因之一是肿瘤直接压迫并刺激神经
D.癌细胞因膜上的蛋白质改变，易被效应T细胞识别而裂解
[答案]A
[解析]癌变是致癌因子使原癌基因和抑癌基因发生了突变，导致正常细胞的生长和分裂失控而变成癌细胞，选项A错误。癌细胞易于分散和转移。癌细胞成为抗原，可被效应T细胞裂解。疼痛的感觉中枢在大脑皮层，长大的肿瘤可压迫神经，产生痛觉。
20.如图为某高等动物细胞分裂图像及细胞内同源染色体对数的变化曲线，据图分析下列有关叙述错误的是()
A.若细胞甲、乙、丙、丁均来自该动物的同一器官，此器官是睾丸
B.曲线图中可能发生基因重组的是FG段
C.细胞甲、乙、丙、丁内染色体数和核DNA分子数的比值是11的有甲、乙，具有4个染色体组的有甲、丙
D.CD段着丝点分裂，染色体加倍，所以对应于甲细胞
[答案]C
[解析]由丙图细胞均等分裂可知，该动物是雄性，所以该器官为睾丸，A正确;基因重组发生在减数第一次分裂前期和后期，此时细胞中有同源染色体，对应图FG段，B正确;图中丙只有2个染色体组，C错误;CD段同源染色体对数加倍是由于着丝点分裂引起，CD段属于有丝分裂后期，对应甲细胞，D正确。
二、非选择题(50分)
21.(10分)如图甲是某高等动物细胞亚显微结构示意图，图乙是该动物体内5个不同分裂时期细胞图。请据图回答以下问题：
(1)研究表明，结构②的功能越复杂，其上的________种类和数量就越多。癌细胞易扩散和转移，这与②表面的________等物质减少有关。
(2)与甲细胞分裂有关的细胞器有________(填标号)，③在__________________加倍(填时期)。
(3)在有丝分裂过程中，能观察到⑨的时期有三个，请写出：________________________________________________________________________。
(4)在乙图中：含有四个染色体组的细胞分裂图像有________(填字母)，不含同源染色体的是________(填字母)，[⑩]染色体上有________个DNA分子。属于减数第一次分裂特有的图像的是______________。
(5)乙图B中所处时期存在的遗传变异形式有__________________________________。
[答案](1)蛋白质糖蛋白(2)①③⑥间期
(3)间期、前期、末期(4)BD2A、E(5)染色体变异
[解析](1)功能越复杂的细胞膜，蛋白质种类和含量越多。癌细胞细胞膜表面的糖蛋白减少。
(2)与动物细胞分裂有关的细胞器是线粒体、核糖体和中心体;中心体在间期复制。
(3)⑨是核膜，能看到核膜的时期是间期、前期、末期。
(4)B是有丝分裂后期，染色体组是四个;D是减数第二次分裂后期，没有同源染色体;A图同源染色体分离，属于减数第一次分裂后期;E图，同源染色体正在联会，处于减数第一次分裂前期。
(5)基因突变存在于间期，基因重组存在于减数第一次分裂，B图所处的时期是有丝分裂后期，存在的变异方式只有染色体变异。
22.(10分)近年来，有关肿瘤细胞特定分子的靶向治疗研究进展迅速。研究发现，蛋白X是细胞膜上的一种受体，由原癌基因X编码，在一些肿癌细胞中，原癌基因X过量表达会持续激活细胞内的信号传导，启动细胞DNA的复制，导致细胞异常增殖，利用动物细胞融合技术制备的单克隆抗体，可用于诊断和治疗原癌基因X过量表达的肿瘤，请回答下列问题：
(1)同一个体各种体细胞来源于受精卵的分裂与分化。正常情况下，体细胞核遗传信息相同的原因是__________________________________________________。
(2)通过检测原癌基因X的________和________可判断其是否转录和翻译。检测成人多种正常组织后，发现原癌基因X只在乳腺、呼吸道等上皮细胞中有微弱表达，这说明___________________________________________________。
(3)根据以上信息，可推测原癌基因的主要功能是________________________。
(4)制备该单克隆抗体时，免疫动物的抗原可以是________。B淋巴细胞识别抗原并与之结合，之后在适当的信号作用下增殖分化为________和________。
(5)用该单克隆抗体处理原癌基因X过量表达的某肿瘤细胞株，发现其增殖能力明显下降。这是因为______________________________。
[答案](1)亲代细胞通过有丝分裂将复制后的核DNA平均分配到两个子细胞中
(2)mRNA蛋白质原癌基因X的表达具有(组织)特异性
(3)维持细胞周期，控制细胞生长和分裂的过程
(4)蛋白X浆细胞记忆细胞
(5)该单克隆抗体与肿瘤细胞表面的蛋白X特异性结合，从而阻断蛋白X介导的信号传导
[解析]本题考查细胞癌变与单克隆抗体的制备与应用。考查理解能力、分析能力和解释能力。(1)体细胞通过有丝分裂进行增殖，保持了核基因组的完整性。(2)转录是合成信使RNA的过程，而翻译是合成蛋白质的过程;虽然各种体细胞中都有原癌基因，但只有某些细胞才表达，这说明原癌基因X的表达具有(组织)特异性。(3)通过题目信息可知，原癌基因是通过控制受体蛋白的合成来控制细胞内信号传导，启动DNA的复制;(4)由于原癌基因X能维持细胞周期，控制细胞生长和分裂的进程;B淋巴细胞受到抗原刺激后能分化产生记忆细胞和浆细胞;(5)由于抗体能与抗原(蛋白X)结合，而蛋白X为细胞膜上的受体，从而阻断了信号传导。
23.(10分)如图所示的是有关胚胎干细胞的部分去向示意图，①～③表示不同的过程，a～d表示不同的细胞。请据图回答：
(1)图中①表示________过程，a和b分别是________和________细胞，其中，③过程是在什么情况下出现的?________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)个体发育过程中最原始的干细胞是________，图中涉及的三类干细胞中，细胞分化程度由高至低的顺序是___________________________________________________。
(3)近年来研究发现，造血干细胞还有可能分化成为其他组织的细胞，说明动物细胞也可能具有________，从理论上解释是因为___________________________________________。
(4)研究干细胞的目的包括________。
A.对某些疾病进行治疗
B.医学上的组织修复
C.研究细胞的分化机制
D.实现细胞全能性
[答案](1)分裂、分化浆细胞记忆B在抗原刺激下
(2)受精卵神经组织干细胞、骨髓造血干细胞、胚胎干细胞
(3)全能性每个细胞都是由受精卵发育而来的，都具有全套的遗传物质
(4)A、B、C
[解析]图中①表示胚胎干细胞分裂和分化的过程，a和b分别是浆细胞和记忆B细胞，在抗原刺激下，机体可发生体液免疫或细胞免疫，即发生③的过程;个体发育过程中最原始的干细胞是受精卵，图中涉及的三类干细胞中，细胞分化程度由高至低的顺序是神经组织干细胞、骨髓造血干细胞、胚胎干细胞;造血干细胞还有可能分化成为其他组织的细胞，说明动物细胞也可能具有全能性，因为每个细胞都是由受精卵发育而来的，都具有全套的遗传物质;人们对干细胞的研究可以对某些疾病进行治疗，可以进行医学上的组织修复，还可以帮助人们了解细胞的分化机制。
24.(10分)
某同学从资料中获知，二氯二乙胺能抑制癌细胞的增殖，并设计了如下实验加以验证。
实验材料：二氯二乙胺溶液，蒸馏水，生理盐水，细胞培养液(内有小鼠肝部肿瘤细胞)，试管等。
实验的主要步骤如下表所示：
试管编号
步骤12345Ⅰ加入等量的细胞培养液(含有全部营养物质与小鼠肝部肿瘤细胞)Ⅱ计算试管内的细胞数目，记录数据Ⅲ加入__a__溶液加入__b__Ⅳ振荡后，在冰箱中培养Ⅴ一段时间后，计算试管内的细胞数目，记录数据(1)完成步骤Ⅱ：
a.________________________________________________________________________;
b.________________________________________________________________________。
(2)纠正步骤Ⅳ中的错误：____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)根据纠正后的正确方法进行实验，结果如下：
试管编号12345二氯二乙胺溶液浓度(mg/mL)0.10.20.30.40步骤Ⅱ记录的细胞数目(个/mL)350363342335336步骤Ⅴ记录的细胞数目(个/mL)32027518696560结论：
①________________________________________________________________________
________________________________________________________________________;
②________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
[答案](1)a.等量不同浓度的二氯二乙胺
b.等量生理盐水
(2)“冰箱中”应改为“适宜温度下”(或恒温箱中)
(3)①在一定范围内，二氯二乙胺能抑制癌细胞的增殖
②随二氯二乙胺溶液浓度的增大，抑制作用逐渐增强
25.(10分)(2015·福建，26)为了研究从植物中提取的可可碱是否可以作为除草剂，某科研小组开展了可可碱对鬼针草根尖细胞有丝分裂和种子萌发影响的实验探究，结果如下表。请回答：可可碱浓度
(mmol·L-1)根尖细胞有丝分裂种子发芽率(%)有丝分裂指数(%)分裂期细胞占比(%)前期和中期后期和末期03.733.040.6981.50.12.902.160.7468.10.52.101.720.3818.61.01.961.720.242.3注：有丝分裂指数=分裂期细胞数/观察细胞的总数×100%
(1)本实验需要制作根尖细胞有丝分裂装片，制片过程中根尖解离需要用到的试剂是________。右图为显微镜下观察到的部分细胞图像，箭号所指的细胞处于分裂期的________期。
(2)实验结果显示，与对照组相比，当可可碱浓度达到1.0mmol·L-1时，在分裂期的细胞中，后期和末期的细胞数目相对________。产生这种结果的原因可能是________________________________________，导致染色体无法移向细胞两极。
(3)实验结果表明，随着可可碱浓度的升高，种子发芽率________。为探究可可碱影响种子发芽率的可能原因，某同学提出假设：可可碱会降低种子中赤霉素的水平。现欲通过实验检验上述假设，请写出实验设计的基本思路：____________________________。
[答案](1)盐酸(或盐酸和酒精)中
(2)减少可可碱能够抑制纺锤体的形成
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