医学细胞生物学笔记范例(12篇)
时间：2024-04-08
时间：2024-04-08
通讯作者：张晓晖
【摘要】目的了解康复科病房医院获得性细菌感染的病原菌及耐药情况。方法对笔者所在医院康复科病房2005年1月～2009年3月所有细菌分离株及其耐药进行监测和分析。结果细菌总数503株,革兰阴性杆菌59.7%,革兰阳性球菌27.6%,真菌12.5%；革兰阳性菌中,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）占金黄色葡萄球菌的99%,耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCN）占凝固酶阴性葡萄球菌94%；革兰阴性菌中,铜绿假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、不动杆菌属、大肠埃希菌、黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、脑膜脓毒金黄杆菌、少动鞘氨醇单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌分别占31.4%、18%、13.7%、9.3%、6.5%、6.1%、4.7%、3.6%和2.8%,其他菌占4.1%；亚胺培南、阿米卡星、头孢他啶、环丙沙星对革兰阴性-菌的敏感率分别为58.8%、53.5%、46.1%和57.5%；万古霉素对MRSA、MRCN及肠球菌属的敏感率均为100%。结论康复科病房感染以革兰阴性菌感染为主,细菌耐药率明显升高,监测细菌分布及耐药性变化非常重要。
【关键词】康复科病房；医院感染；抗生素；耐药
NosocomialbacterialinfectioninrehabilitationwardZHANGXiao-hui.XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000，China
【Abstract】ObjectiveToestablishtheprevalenceofnosocomialbacterialinfectionandresistanceinarehabilitationward.MethodsWeretrospectivelyanalyzedallthebacterialisolatesintherehabilitationwardofourhospitalfrom2005to2009.ResultsAmongallthebacterialisolates（n503）,thepercentageofGram-negativebacilli,Gram-positivesandfungiwere59.7%,27.6%and12.5%respectively.MeticillinresistantStaphylococcusaureuscountedfor99%ofStaphylococcusaureusandmeticillinresistantcoagulasenegativeStaphylococcuscountedfor94%ofcoagulasenegativeStaphylococcus.ThepercentageofPseudomonasaeruginosa,Stenotrophomonasmaltophilia,Acinetobacterspp,Enterococcusspp,Serratiamarcescens,Klebsiellapneumoniae,Chryseobacteriumspp,SphingomonaspaucimobilisandBurkholderiacepaciaaccountedfor31.4%,18%,13.7%,9.3%,6.5%,6.1%,4.7%,3.6%and2.8%ofGram-negativebacillirespectively.ThesusceptiverateofGram-negativebacteriatomipenem,amikacin,ceftazidime,ciprofloxacinwere58.8%,53.5%,46.1%and57.5%respectively.Thesusceptiverateofmeticillin-resistantS.aureus,meticillinresistantcoagulasenegativeStaphylococcusandEnterococcustovancomycinwasall100%.ConclusionGram-positivesbecomeimportantpathogensofnosocomialinfection.Mostpathogensshowsignificantresistancetothemostcommonlyusedantibiotics.Itisveryimportanttomonitorthedistributionofbacteriaandtheirresistancetoantibiotics.
【Keywords】Rehabilitationcenter；Nosocomialinfection；Antibiotic；Resistance
院内感染细菌耐药性日趋严重,成为近年来备受关注的问题［1］,由于康复科病房老年患者、抵抗力低下患者数目多，且有创操作及手法治疗均增加了病房内的细菌感染的机率，且细菌耐药问题尤为严重。为了解笔者所在医院康复科病房的细菌流行病学及其耐药的特点,指导临床治疗,合理使用抗生素以提高危重患者的救治成功率,笔者对该病房分离菌株和耐药性进行监测及统计,现将结果报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料2005年1月～2009年3月,从康复科病房患者的呼吸道、血液、皮肤、尿液中,共分离出细菌503株。细菌培养鉴定按全国临床操作规程。同一患者7d内的相同菌种标本视为同一菌株,不重复药敏鉴定,不计入菌株总数。
1.2方法采用全自动微生物生化分析仪（VITEK系统）NFC卡鉴定细菌菌株,VITEK2-compact进行抗生素耐药试验,按美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）2001年版药敏指南为判断标准。
1.3统计学方法记录标本收集时间、部位及药敏资料,用SPSS11.0软件进行统计学处理。
2结果
2.1细菌分离菌株总数共计503株,其中痰372株,占74.0%；血液60株,占11.9%；皮肤41株,占8.1%；尿液30株,占6.0%。
2.2菌谱变化所有菌株中,革兰阳性球菌共138株,占27.6%。革兰阳性菌中主要为葡萄球菌属,占72.4%,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）60.3%,耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCN）13.4%。革兰阴性菌332株,占65.8%,其中铜绿假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、不动杆菌属、大肠埃希菌、黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、脑膜脓毒金黄杆菌、少动鞘氨醇单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌分别占31.4%、18.0%、13.7%、9.3%、6.5%、6.1%、4.7%、3.6%和2.8%,其他菌占4.1%，真菌33株,占6.6%。
2.3细菌对抗菌药物的耐药性
2.3.1革兰阳性球菌共检出金黄色葡萄球菌（SAU）90株,99%MRSA,万古霉素100%、替考拉宁100%、利奈唑安100%敏感,利福平全部耐药；凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）18株,其中MRCN17株,万古霉素100%、替考拉宁100%、利奈唑安100%敏感,利福平敏感率57%。肠球菌对庆大霉素的耐药率达57%。
2.3.2非发酵菌铜绿假单胞菌对头孢他啶和亚胺培南的耐药率分别为51.9%、46.9%,对环丙沙星的耐药率为35.8%,对阿米卡星的耐药率为34.3%。嗜麦芽寡养单胞菌除对环丙沙星耐药率为38.6%,对其余各种药物均呈高度耐药。不动杆菌属除对亚胺培南相对敏感外,为68.7%,其余药物耐药率均较高。见表1。
表1康复科革兰阴性杆菌对常用抗菌药物的耐药率（n，%）
2.3.3大肠埃希菌和克雷伯菌产酶率大肠埃希菌和克雷伯菌属产超广谱β-内酰胺酶,耐药率分别为33.3%和62.5%。对哌拉西林耐药率分别为33.3%和51%,对哌拉西林他唑巴坦耐药降低,分别为12.5%和26.9%。第三代头孢菌素（头孢曲松、头孢他啶）对肺炎克雷伯菌高度耐药。大肠埃希菌对头孢他啶和环丙沙星的耐药率都高达99%。
3讨论
本资料可以发现康复科病房感染细菌耐药的严峻形势：以革兰阴性杆菌感染为主,占65.8%；革兰阳性球菌占27.6%,其中大多数是MRSA和MRCN；真菌感染占相当比例6.6%。各部位培养出的细菌与国外报道基本一致［2］。革兰阴性菌更趋耐药,对亚胺培南高度耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、黄杆菌属等少见菌株增加。导致这种现象的原因可能在于亚胺培南和美罗培南等碳青酶烯类药物的广泛使用。大量研究结果证实,对重度感染患者起始恰当的充分治疗（覆盖其可能的致病菌）,会大大降低患者死亡率［3,4］。由于康复科病房免疫力低下患者数目多，且有创操作及手法治疗均增加了病房内的细菌感染的机率，细菌耐药问题尤为严重，因此，收治初始选择强有力的抗生素是必要的。
由于第三代头孢菌素可被AmpC酶和ESBLs破坏,耐药严重,治疗肠杆菌属和沙雷菌属感染时应避免使用,首选碳青霉烯类药物和加酶抑制剂抗生素的机会大大增加,导致了高度耐药菌株的增加。下呼吸道分泌物中仍以铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌为多,嗜麦芽寡养单胞菌比例较高。其他部位感染尤其是皮肤以革兰阳性球菌为多。革兰阴性杆菌中,铜绿假单胞菌仍位居首位,且多为多重耐药。据医院感染危险因素及预后因素分析显示,高龄、入住ICU、有支气管扩张基础病、医院获得性肺炎、分离致病铜绿假单胞菌前15d接受氟喹诺酮和碳青霉烯类抗生素治疗等因素均易导致铜绿假单胞菌多重耐药［5］。铜绿假单胞菌耐药率较低的几种抗菌药物依次为环丙沙星（35.8%）、哌拉西林/他唑巴坦（39.5%）、亚胺培南（46.9%）,而对其他抗菌药物耐药率都＞50%。
革兰阴性杆菌中嗜麦芽寡养单胞菌位居第2位,文献［6］报道该菌上升趋势,笔者所在医院康复科病房分离菌株仅次于铜绿假单胞菌,为18%。体外药敏显示头孢菌素类、广谱青霉素类、氨基糖苷类药物高度耐药。本资料显示该菌株仅对环丙沙星耐药率低为38.6%,可作为该菌感染的首选药物。该菌为条件致病菌,其感染的发生与广谱抗菌药物应用、免疫功能低下、侵入性操作有关,因此在使用头孢四代或亚胺培南治疗敏感菌感染时,需考虑它们的天然耐药菌被选择而造成感染,严格控制头孢四代及亚胺培南使用。笔者所在医院康复科病房嗜麦芽寡养单胞菌感染率高,具体原因不明,可能与康复科患者免疫功能低下、大量广谱抗菌药物运用有关。鲍氏不动杆菌位属于第3位,体外药敏结果显示,敏感性较高的依次为亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星,耐药率
肠杆菌科细菌中的大肠埃希菌菌株分离率约为6.5%,标本来自下呼吸道和腹腔,对头孢菌素、环丙沙星高度耐药,近99%。大肠埃希菌耐药率较低的抗菌药物依次为亚胺培南（0%）、哌拉西林/他唑巴坦（12.5%）、阿米卡星（33.3%）。肺炎克雷伯菌对各抗菌药物的耐药情况与大肠埃希菌相似,对酶抑制剂效果较好,对大多数头孢菌素耐药。上述两种菌易产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）,本次调查发现产酶率分别为33.3%和62.5%。ESBLs的产生与临床上大量使用超广谱β-内酰胺类抗菌药物有关。革兰阴性杆菌中分离菌株数部分为脑膜脓毒金黄杆菌,该菌天然耐药,如氨基糖苷类、β-内酰胺类耐药,仅对喹诺酮类和含酶抑制剂抗生素较为敏感。
笔者所在医院康复科病房分离所得的革兰阳性球菌以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRSCN）为主,占84.8%。90株金黄色葡萄球菌和18株凝固酶阴性葡萄球菌中,MRSA、MRSCN分别占99%、94%。对苯唑西林耐药率极高,对万古霉素、替考拉宁、利奈唑安均为敏感。粪肠球菌和屎肠球菌均为万古霉素、替考拉宁和利奈唑安敏感菌株。为了减缓耐万古霉素葡萄球菌,尤其是耐万古霉素肠球菌的出现和增长速度,应适当限用万古霉素,实际工作中面对高度耐药的MRSA及MRSCN,除糖肽类抗生素外,笔者所在医院康复科部分尤其肾功能不全的患者选用利奈唑安。真菌在笔者所在医院康复科病房监测分离菌株中占相当比例,以白色念珠菌为首位,是医院感染的常见菌,主要来源于呼吸道与泌尿道,与广谱抗菌药物及糖皮质激素大量使用,加之康复中心危重患者免疫功能低下,有诸多真菌易感因素,导致真菌感染日益增多。
在调查中发现,同一菌株会出现一定时期的爆发流行。提示病房内消毒隔离措施的重要,尤其医务人员洗手的必要性早已被证实,医护人员接触患者后应彻底洗手或更换一次性手套［7］。本研究提供的资料可以发现目前康复科病房细菌耐药的严峻形势,以高度耐药的革兰阴性菌为著,非发酵菌比例较高,嗜麦芽寡养单胞菌和金黄杆菌属等少见菌株不断增加,主要抗菌药物敏感率普遍下降,MRSA、MRSCN和真菌比例进一步升高。造成上述现象原因为康复中心病房收治对象多为老年危重患者,病程中长期应用广谱抗菌药物,应用多种有创诊断治疗措施等［8］。由于各地区各单位的细菌流行存在较大差异,建立本医院尤其是本病房医院感染的流行病学监测制度,随时了解并定期通报流行情况是非常重要的。熟悉本单位的细菌学资料,当临床出现感染时,首先需要明确可能的感染部位,并根据流行病学资料确定可能的致病菌及其耐药性,合理选择有效抗菌药物。
参考文献
［1］CohenML.Changingpatternofinfectiousdisease.Nature,2000,406（6797）:762-767.
［2］RichardsMJ,EdwardsJR,CulverDH,etal.Nosocomialinfectionsincombinedmedical-surgicalintensivecareunitsintheunitedstates.InfectControlHospEpidemiol,2000,21（8）:501-515.
［3］KollefMH,ShermanG,WardS,etal.Inadequateantimicrobialtreatmentofinfections:ariskfactorforhospitalmortalityamongcriticallyillpatients.Chest,1999,115（2）:462-474.
［4］BochudPY,GlauserMP,CalandraT.Internationalsepsisforum.antibioticsinsepsis.IntensiveCareMed,2001,27（Suppl1）:S33-S48.
［5］曹彬,王辉,朱元珏,等.多重耐药铜绿假单胞菌院内感染危险因素及预后因素分析.中华结核和呼吸杂志,2004,27:31-35.
［6］赵虎,周庭银,陈险峰,等.重症监护室非发酵菌的检出率及其耐药性分析.中国感染控制杂志,2004,3（1）:39-42.
［7］尚少梅,王宜芝,郑修霞,等.促进护理人员洗手行为依从性的研究.中华医院感染学杂志,2003,13（6）:507-510.
摘要:目的:探讨黄芪甲苷(AS-IV)对高糖诱导的足细胞凋亡的作用及其机制。方法:条件性永生的小鼠足细胞分为正常糖组(NG)、高糖组(HG)、甘露醇高渗对照组(MA)及HG+不同剂量(10、50、100μg/mL)黄芪甲苷干预组(AS-IV)。流式细胞仪及Hoechst染色检测细胞凋亡;荧光探针CM-H2-DCF-DA标记细胞检测活性氧(ROS)水平;Western印迹检测足细胞p38-MAPK活性。结果:高糖促进足细胞ROS的产生并引起足细胞凋亡,AS-IV明显抑制高糖诱导的ROS的产生及足细胞凋亡,且呈剂量依赖关系。此外,高糖激活p38-MAPK信号通路,AS-IV呈剂量依赖性抑制p38-MAPK活性。结论:AS-IV能减少高糖所致的足细胞凋亡,其机制可能与AS-IV抗氧化及抑制p38-MAPK活化密切相关。
关键词:黄芪甲苷;高糖;足细胞;凋亡;活性氧;p38-MAPK
中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1673-7717(2010)04-0822-03
AstragalosideIVInhibitedHighGlucose-InducedPodocyteApoptosisandItsMechanism
GUIDingkun1,CHENJianguo1,CHENYifang1,HUANGJianhua2
(1.DepartmentofNephrology,ZhejiangHospital,Hangzhou310013,Zhejiang,China;
2.InstituteofIntegratedChineseandWesternMedicine,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)
Abstract:Objective:TostudytheeffectsofAstragalosideIV(AS-IV)onglucose-inducedapoptosisofpodocytesandexploreitspossiblemechanism.Methods:Conditionallyimmortalizedmousepodocytesweredividedintonomalglucosegroup(NG),highglucosegroup(HG),mannitolgroup(MA)andHGwith10,50and100μg/mLofAS-IVfor24h.FlowcytometryandHoechststaningwereusedforthequantificationofapoptoticpodocytes.Reactiveoxygenspecies(ROS)generationwasmeasuredwiththefluoroprobecarboxymethyl-H2-dichlorofluoresceindiacetate.Theactivationofp38-MAPKwasdeterminedbyWesternblot.Results:HGinducedROSgenerationandapoptosisofpodocytes.AS-IVinhibitedHG-inducedROSgenerationandapoptosisofpodocytesinadose-dependentmanner.Moreover,HGcausedp38-MAPKactivationinpodocytes,whileAS-IVdose-dependentlyinhibitedp38-MAPKactivation.Conclusion:Astragalosidepreventedhighglucose-inducedpodocyteapoptosisandthiseffectmaybeinvolvedininhibitionofROSandp38-MAPK.
Keywords:AstragalosideIV;highglucose;podocyte;apoptosis;ROS;p38-MAPK
收稿日期:2009-11-11
基金项目:浙江省老年医学重点学科群计划项目(2008ZJ006)
作者简介:桂定坤(1978-),男,湖北孝感人,主治医师,博士,从事肾脏病基础与临床研究。
糖尿病肾病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最常见且最严重的并发症之一,若能早期干预治疗DN,仍有希望阻止或延缓病情进展,然而,迄今尚无满意的防治早期DN的方法。近年来研究证实肾小球足细胞凋亡是早期DN进展的关键[1],因此,抑制足细胞凋亡将为防治早期DN带来新的曙光。DN属祖国医学“消渴”、“水肿”、“虚劳”等证范畴,关键病机为气阴两虚。黄芪益气健脾、利水消肿,是临床治疗DN的常用中药,黄芪甲苷(AstragalosideIV,AS-IV)是黄芪的主要活性成分之一,笔者前期研究发现AS-IV能改善高糖刺激下的足细胞黏附,从而保护足细胞[2],本研究进一步探讨AS-IV对高糖诱导的足细胞凋亡的作用及其机制。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器黄芪甲苷(成都思科华生物技术有限公司),RPMI1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司),Hoechst-33342、小鼠γ-干扰素(美国Sigma),Trizol试剂、荧光探针CM-H2-DCF-DA(美国Invitrogen),p38、磷酸化p38抗体(美国SantaCruz),ApoAlertCaspase3荧光检测试剂盒(美国BDBioscience),AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(上海晶美生物技术有限公司),荧光显微镜(日本Olympas),激光共聚焦显微镜、流式细胞仪(美国BIORAD)。
1.2足细胞培养条件性永生的小鼠足细胞由英国LuigiGnudi教授(King'sCollegeLondonSchoolofMedicine,London,UK)馈赠,按原始文献方法[3]培养,培养瓶预先经01mg/mL胶原I在37℃处理1h,细胞生长在含10U/mLγ-干扰素,10%胎牛血清,100U/mL青链霉素,100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中,在5%CO2、33℃培养孵箱传代培养。然后转入37℃、5%CO2培养孵箱分化14天后进行实验。
1.3细胞处理及分组生长状态良好的足细胞种植于经胶原I处理的培养板中,当细胞生长至60%～70%时,换1%胎牛血清培养液培养24h同步化,然后分为:①正常糖对照组(NG):D-葡萄糖5mmol/L;②高渗对照组(MA):甘露醇25mmol/L+D-葡萄糖5mmol/L;③高糖刺激组(HG):D-葡萄糖30mmol/L;④高糖刺激+AS-IV干预组:不同剂量(10、50、100μg/mL)AS-IV干预24h。
1.4细胞凋亡检测①流式细胞仪检测足细胞凋亡率:上述已分化足细胞经同步化处理后,根据不同实验分组处理细胞,然后用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,细胞刀刮下重悬于1×结合缓冲液中,调整待测细胞浓度为1×106个/mL,取100μL细胞悬液加入反应管中,然后分别加入5μLAnnexinV-FITC和5μL碘化丙啶(PI),轻轻混匀,避光室温反应15min,加入400μL1×结合缓冲液,筛网过滤后用流式细胞仪检测,计算凋亡率。
②Hoechst-33342染色检足细胞凋亡率:上述不同实验组细胞以甲醇、冰乙酸混合液(体积比为3∶1)固定10min,用PBS冲洗两次,加入终浓度为5μg/mL的Hoechst-33342,避光室温孵育30min,30%缓冲甘油封片。然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察,各组随机选取不重叠10个视野计数细胞总数和凋亡细胞,计数200个细胞,计算凋亡细胞占总细胞数的百分比(凋亡率),重复实验3次。
1.5足细胞ROS检测用ROS特异性荧光探针CM-H2-DCF-DA标记细胞ROS水平,将上述各实验组细胞放入含10μmol/LCM-H2-DCF-DA的PBS中37℃孵化45min,然后用PBS冲洗并收集细胞,用激光扫描共聚焦显微镜检测ROS水平。
1.6Western印迹分析足细胞p38-MAPK活性收集上述各实验组细胞以冷PBS洗涤两次后分别裂解细胞,4℃15000r/min离心10min后留取裂解液上清,用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。以12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,电泳完毕后将凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。室温下以5%脱脂奶粉封闭,用抗磷酸化p38MAPK抗体4℃孵育过夜,然后再与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h,DAB显色。用ECL化学发光剂处理,胶片曝光,扫描并定量分析胶片条带的光密度,重复3次独立实验。
1.7统计学方法计量数据采用±s表示,组间比较采用单因素方差分析,用SPSS11.0统计软件分析。P
2结果
2.1黄芪甲苷(AS-IV)对高糖诱导的足细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测到高糖(HG)刺激24h后足细胞凋亡显著增加(P
注:NG:正常糖对照组;MA:高渗对照组;HG:高糖刺激组
与NG组相比,*P
图1流式细胞仪(A)及Hoechst-33342染色(B)检测
不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞凋亡的影响
2.2AS-IV对足细胞ROS水平的影响与NG组相比,HG组足细胞内ROS水平显著增加(P005),而AS-IV能呈剂量依赖性减少足细胞ROS水平,在10μg/mL剂量时发挥作用,在100μg/mL剂量时达高峰(P
注:NG:正常糖对照组;MA:高渗对照组;HG:高糖刺激组。
与NG组相比,*P
图2不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞ROS水平的影响
2.3AS-IV对足细胞p38-MAPK活性的影响与NG组相比,HG刺激显著激活p38-MAPK信号通路(P0.05)。而AS-IV能显著抑制高糖诱导的足细胞p38-MAPK活化,其作用呈明显剂量依赖关系,在100μg/mL剂量时作用最显著(P
注:NG:正常糖对照组;MA:高渗对照组;HG:高糖刺激组。
图3不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞
p38-MAPK活化的影响
3讨论
DN属中医“消渴”、“水肿”、“尿浊”、“虚劳”等范畴。病位在肝、脾、肾,基本病机为气阴两虚,并兼夹瘀血、水湿、痰浊等标证。本虚标实、虚实夹杂的病机特点和复杂的病机演化规律决定了DN中医证型的多样化。研究报道[4]认为DN是在“消渴”气阴两虚的基础上发展起来的,气阴虚损、血瘀阻络贯穿本病始终。黄芪有补气升阳,固表止汗,利尿消肿等功效,一直作为治疗DN的常用药物在临床中广泛使用,黄芪甲苷(AS-IV)是黄芪的有效药理成分之一,本研究首次发现AS-IV能明显抑制高糖所致的足细胞凋亡,将为防治早期DN开辟一条新途径。
大量研究表明DN早期就可出现足细胞凋亡,继而加重疾病进展,最近动物实验证实1型及2型DN足细胞凋亡均显著增加[5],且足细胞凋亡比足细胞脱落剥离、微量白蛋白尿及细胞外基质增生发生更早,提示足细胞凋亡是早期DN进展的新机制[1]。笔者采用流式细胞仪及Hoechst染色检测细胞凋亡,均发现黄芪甲苷(AS-IV)能呈剂量依赖性抑制高糖诱导的足细胞凋亡,其中100μg/mL抑制作用最明显,提示AS-IV对高糖诱导的足细胞凋亡具有明确的抑制作用。
氧化应激是引起早期DN进展的重要机制,早期DN产生的氧化应激以形成活性氧(ROS)为特征,现已证实ROS是引起足细胞凋亡的重要因素[1],高糖能直接促进足细胞ROS的产生[6],并通过p38-MAPK信号通路诱导足细胞凋亡[1]。AS-IV具有广泛的药理作用,抗氧化是AS-IV的重要研究领域之一,体内和体外实验均已证实AS-IV有明确抗氧化作用,从而减轻心肌缺血损伤[7]。本研究发现AS-IV呈剂量依赖性抑制高糖诱导的足细胞凋亡及足细胞ROS的产生,提示AS-IV可能通过抗氧化作用抑制足细胞凋亡。
丝裂原激活的蛋白激酶(mitogenactiveproteinkinase,MAPK)信号通路在早期DN足细胞凋亡中的作用越来越受到人们的关注。MAPK是调控细胞生长与凋亡过程的重要信号途径,包括p38-MAPK、c-Jun-N末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)等主要亚型。细胞外刺激经过激酶级联反应将信号传导至胞核而调控细胞生长和凋亡,在细胞对生长因子和环境应激的反应过程中,MAPK信号通路起关键作用[8],其中p38在细胞凋亡、细胞因子产生、转录调节和细胞骨架重组中起至关重要的作用,p38激活可引起转录、蛋白合成、细胞表面受体表达和细胞骨架结构方面的过度变化,最终导致细胞凋亡[9]。现已证实p38-MAPK信号通路异常激活是导致早期DN足细胞凋亡的关键环节[1]。笔者发现高糖能显著激活p38-MAPK信号通路,而AS-IV能抑制高糖诱导的足细胞p38-MAPK活化,其作用呈明显剂量依赖关系。ROS与MAPK激活之间的关键联系可能与氧化应激通过凋亡信号调节酶-1(apoptosissignalregulatingkinase1)激活p38-MAPK有关[10],因此,笔者认为AS-IV缓解高糖诱导的足细胞凋亡的机制与其减少足细胞ROS水平及抑制p38-MAPK的活化密切相关。
综上所述,笔者研究表明中药黄芪的主要药理成分AS-IV能显著缓解高糖所致的足细胞凋亡,其机制可能与AS-IV抗氧化及抑制p38-MAPK活化密切相关,因此,AS-IV可能成为防治早期DN的潜在新型中药单体,值得进一步研究和开发。
参考文献
[1]SusztakK,RaffAC,SchifferM,etal.Glucoseinducedreactiveoxygenspeciescauseapoptosisofpodocytesandpodocytedepletionattheonsetofdiabeticnephropathy[J].Diabetes,2006,55:225-233.
[2]陈建国,桂定坤,牟利军,等.黄芪甲苷对高糖刺激下的足细胞黏附功能的保护作用及机制[J].中华肾脏病杂志,2009,25(3):227-232.
[3]MundelP,ReiserJ,BorjaAZ,etal.Rearrangementofthecytoskeletonandcellcontactsinduceprocessformationduringdifferentiationofconditionallyimmortalizedmousepodocytecellline[J].ExpCellRes,1997,236:248-58.
[4]黄翠玲,李才,邓义斌,等.济肾汤对糖尿病大鼠肾脏病变的影响[J].中国中西医结合杂志,1997(1):676.
[5]NiranjanT,BieleszB,GruenwaldA,etal.TheNotchpathwayinpodocytesplaysaroleinthedevelopmentofglomerulardisease[J].NatMed,2008,14(3):290-298.
[6]HoshiS,NomotoK,KuromitsuJ,etal.HighglucoseinducedVEGFexpressionviaPKCandERKinglomerularpodocytes[J].BiochemBiophysResCommun,2002,290:177-184.
[7]ZhangWD,ChenH,ZhangC,etal.AstragalosideIVfromAstragalusmembranaceusshowscardioprotectionduringmyocardialischemiainvivoandinvitro[J].PlantaMed,2006,72:4-8.
[8]CanoE,MahadevanLC.ParallelsignalprocessingamongmammalianMAPKs[J].TrendsBiochemSci,1995,20:117-122.
关键词免疫学基础与病原生物学；多媒体教学；课件
中图分类号：G642.4文献标识码：B
文章编号：1671-489X（2015）17-0139-03
在现代教育技术的不断更新和发展的大背景下，运用多媒体计算机来辅助教学的技术在各级各类教学中的运用逐渐普及，它将多媒体计算机与文字、图片、声音、视频、动画等多种教学资源和信息有机结合为一体，是一种被广大教师广泛采用的教学手段，在高校、中学和小学等教学实践中取得较好的教学效果。
免疫学基础与病原生物学是医学专业的一门非常重要的基础课程，也是连接临床的桥梁课程。本课程教学内容抽象，知识点多而繁杂，部分内容抽象难理解。例如：医学免疫学内容抽象，看不见摸不着，理解起来非常困难；病原生物学内容繁杂，知识点多而枯燥，不易掌握和记忆，本校历届中医药专业的学生普遍反映本课程难学，每年考试不及格的人数相当多。加上在中医药院校本课程的开课学时普遍偏少，教师在教学过程中无法详细展开讲授教材的内容，无疑加大了学习的难度。因而，传统的教学方法和手段已经不能满足本课程的教学要求，必须进行教学内容和教学方法的改革。
笔者自2009年下学期开始制作《免疫学基础与病原生物学》多媒体课件并运用到本课程的教学，经多年的教学实践，取得较好的教学效果，但同时也发现一些存在的问题，现总结如下。
1本课程采用多媒体教学的优势
静态图片与视频动画结合，有利于调动和提高学生的学习兴趣本课程包括“医学免疫学”“医学微生物学”和“人体寄生虫学”等三个部分的内容，不仅教学内容抽象难懂、枯燥乏味，而且内容多而杂，要求学生掌握的内容非常多。但中医药院校的教学课时与西医院校相比较明显偏少，这对任课教师提出更高的要求，不仅要在有限的课时内讲授更多的知识，而且要让学生能够听懂、理解和掌握。传统的教学模式以教师课堂讲授为主，一些抽象的内容（如医学免疫学部分的抗原、抗体、补体的概念非常抽象）不好理解，也很难形象地展示在学生面前。而多媒体教学的课件往往图文并茂、动静结合，通过将大量静态图片与动态视频和动画相结合、文字与语言相结合的方法，使枯燥的教学过程转变为生动活泼的教学过程，极大地刺激学生的眼、耳、大脑等多种器官，学生很容易接受，加上展示过程生动形象，在课堂教学中可以充分活跃课堂气氛，极大提高学生的学习兴趣。
如在讲授医学免疫学的“补体系统”一章时，补体的激活过程非常抽象，为了便于学生理解，参照国外教学资源制作了补体激活的动画过程，通过动画形式展示三条补体激活途径中从补体与激活物的结合开始，至C3转化酶、C5转化酶、膜攻击复合物形成以及靶细胞溶解的完整过程，同时结合大量图片对三条补体激活过程作了系统比较；在讲授人体寄生虫如钩虫、蛔虫、鞭虫和蛲虫的生活史时，通过大量的视频资料展示虫体的生长发育与感染的动态过程等。通过图片与视频素材的综合应用，使本课程的教学内容形象、生动，极大地激发了学生的学习兴趣与积极性，显著增强了教学效果。
静态图片与视频动画结合，有利于重点与难点内容的掌握与理解本课程“医学免疫学部分”有许多内容如免疫球蛋白结构、MHC分子对抗原的提呈、T细胞与B细胞对抗原的应答过程、I-IV型超敏反应的机理等内容抽象难懂，运用传统的教学方法往往难以将其讲解透彻，而这些内容又是本课程教学的重点与难点，学生对其理解、掌握的程度与教学效果关系密切。因而在本课程的多媒体教学中，笔者借助大量静态的平面与立体图片，并结合相关的视频对其进行详细讲授，学生通过直观、生动的图片和视频轻松理解和掌握课程的重点和难点内容。
如在讲授免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）时，运用Ig平面及立体结构图片，详细讲授其基本结构与功能分区，在此基础上结合动画讲授解不同水解蛋白酶对Ig的作用部位及水解片段的生物学作用；在讲授MHC分子对抗原的提呈作用时，通过网上下载的动画将MHC分子对内源性和外源性抗原的提呈过程完整展示出来，并在此基础上进一步讲解MHC分子的遗传特点及其在临床组织器官移植方面的应用；在讲授T细胞与B细胞对抗原的应答过程时，通过大量的图片和视频显示抗原的加工处理和提呈过程、处理后的抗原如何被T、B淋巴细胞识别结合以及T、B淋巴细胞如何活化、增殖和分化为效应细胞的具体过程，并在此基础上进一步结合动画讲授效应细胞如何发挥免疫效应和清除抗原异物的生物学作用，通过图片、视频和动画的综合运用，让本来抽象难懂的免疫应答过程很容易被学生理解和掌握；在讲授Ⅰ-Ⅳ型超敏反应时，运用大量图片和视频展示各个不同类型的超敏反应机理的要点和区别，如Ⅰ型超敏反应中大量IgE抗体的形成及其结合于肥大细胞和嗜碱性粒细胞导致机体处于致敏状态是引起此类反应的关键，Ⅱ型超敏反应中自身抗体与靶细胞上抗原结合或自身抗体与抗原结合形成免疫复合物再吸附于靶细胞是引起此类反应的关键，Ⅲ型超敏反应中中等大小可溶性免疫复合物的形成、免疫复合物在毛细血管壁上的沉积以及通过激活补体所造成的组织损伤是此类反应发生的关键等。
通过近五年的多媒体教学情况课堂调查结果显示，超过83.8%的学生认为多媒体课件的应用大大提高了对本课程中重点和难点内容的掌握和理解。
能够提供大量的信息，丰富了教学内容，有利于提高学生的综合素质由于多媒体课件的特殊表现形式，极大扩充了课堂教学内容的容量，除了课本知识以外，教师在制作多媒体课件时还可将与授课内容相关的静态图片、视频、动画、文本、声音等各种素材加入到课件中，使学生在有限的时间内可以学到更多书本上没有的知识，解决了传统教学方式中教师花费大量的时间去板书，而学生获取的信息量偏少的问题[1]。如在讲授细菌各论时，细菌的种类繁多，每种细菌都会涉及生物学性状、致病性、免疫性、微生物学检查以及防治原则等内容，要求掌握的知识点多而杂，而学生没有临床经验和感性认识，导致学生在学习这些抽象知识的过程中难度很大。为了克服这一难题，在多媒体课件中将每种细菌感染所引起的典型临床表现图片放在课件的首页，然后应用一个典型病例，通过图片展示病人的主诉、病史、症状、体征，再提出相关诊断和治疗方面的问题，就可牢牢抓住学生的好奇心；在此基础上再讲授细菌的基本知识和理论，让学生在问题的基础上去学习理论知识，就可保证学生在学习时不再感觉枯燥乏味，而是积极学习解决问题的办法。
利用多媒体课件开展免疫学基础与病原生物学课程教学，不仅保证了课程重点和难点的教学效果，而且让教师有时间、有机会在课堂上讲授本课程的新知识、新理论和新技术等。通常来讲，专业教科书和教材的出版周期较长，不能及时将学科的一些新知识、新成就和新进展写进教材，加上教学课时的限制和不足，教师没有时间将这些新知识传授给学生。而多媒体课件的制作灵活多变，通过将这些知识插入相关内容的多媒体课件中，就可很方便地介绍给学生。
如2010年下学期上课期间，正值“甲型H1N1流感病毒”从美国开始流行，笔者从英特网上收集、整理了大量的有关“甲型H1N1流感病毒”的图片、视频等素材，并运用这些素材生动形象地向学生讲解了当时国内外“甲型H1N1流感病毒”的流行情况、传染源、常见传播途径、实验室与临床诊断标准、防治原则及中医药抗流感病毒的作用特点。通过将这些最新研究结果的引入，不仅激发了学生学习本课程的积极性，同时开阔了学生的视野，加强了医学生的责任感，也有利于提高学生的综合素质。
2多媒体教学的不足
多媒体教学是现代教学手段的标志，在中医药教学活动中多媒体教学手段的应用提高了中医药院校学生学习免疫学基础与病原生物学课程的热情，保证了教学质量，也体现了多媒体教学在教学过程中的优势。但是在教学过程中对多媒体的使用不科学，也会给中医药教学活动带来不利的影响。笔者认为在多媒体教学过程中容易出现的问题主要有以下几个方面。
1）多媒体课件的制作质量差。课件制作的质量直接影响到教学质量和效果，有些课件直接将原来板书在黑板上的内容输入电脑，只是简单地将多媒体屏幕当成黑板来使用；有的教师只是盲目追求多媒体课件画面的美观，而忽视了基本的教学内容，虽然能够吸引学生，但是重点不突出，要掌握的内容没有充分展示出来，影响教学质量和教学效果；有的教师在制作多媒体课件的过程中，将所有的书本内容都罗列到多媒体课件中，导致在教学过程中重、难点不分。由于受到时间的限制，导致在教学过程中部分教师只能照本宣科，学生没有时间做笔记，甚至幻灯片还没有看清，教师就播放下一张，结果学生一头雾水、头晕目眩。因此，教师应依据本课程的教学大纲，把握重点和难点内容，以教材为蓝本来制作多媒体课件，精炼教学内容，突出重点内容。课件采用的图片、视频资料要清晰，动画要简洁了当，素材补充应以教学重点、难点为主。
2）忽略教学过程中的互动，影响课堂教学质量。教师要明确一点：多媒体教学只是一种辅助教学手段，在教学过程中一定要突出教师的主导作用。有的教师在应用多媒体课件教学时，过度依赖多媒体课件，对教学内容不熟悉，把脸转向屏幕，照着幻灯片把内容读出来；有的教师坐在电脑前，看着幻灯片宣读，板书很少，与学生基本没有交流，忽略师生之间的互动。这一点在各高校的多媒体教学检查中均发现有类似现象。因此，在进行多媒体教学时，教师首先要熟悉教学内容，把握教学重点，在此基础上注意采用多种教学方法来活跃课堂教学气氛，加强与学生的交流。如幻灯片的切换速度，教师要根据学生的反映情况进行适当调整，可以通过口头语言和肢体语言与学生互动，遇到重点、难点内容要提醒学生，要讲透，同时要在黑板上进行板书等。
3结语
综上所述，采用多媒体课件开展免疫学基础与病原生物学课程的教学，对于提高中医药院校学生的学习兴趣、保证教学质量有其独特的优势，但是在实践教学过程中也会出现一些比较严重的问题。为此，教师在利用现代多媒体技术进行教学的过程中，必须对教学大纲有着熟悉的把握，能对教材内容进行系统的把握；另一方面需要对传统的教学方法和教学模式进行改革。在教学过程中只有将传统的教学方法和现代多媒体教学技术有机结合起来，才能有效提高教学质量，实现教学目标。
参考文献
[1]曹朝晖，李邦良，佘美华，等.生物化学CAI课件在教学中的应用[J].中国医学教育技术，2006，20（3）：185-187.
通过多年的教学实践证明，三步教学法，容易被学生所接收是个很好的教学思路，值得推广，现介绍如下。
板面的书写
肿瘤的基本概念：肿瘤是人体中正在发育的或成熟的正常细胞，在不同的相关因素长期作用下，出现过度增生或异常分化而形成的新事物，也就是细胞产生的赘生物细胞群。有良性的，也有恶性的。良性肿瘤一般情况下，不影响人的健康。根据所处的部位与大小，可手术切除，愈后良好。恶性肿瘤就是癌症。癌症给人类健康和生命带来了严重危胁，攻克癌症、战胜癌症、行之有效的治疗癌症是全球都在研究的课题。它与正常的组织和细胞完全不同，不遵循新陈代谢规律生长，不受约束与控制，没有规律的快速生长，破坏正常组织器官，使其功能丧失。恶性肿瘤细胞向周围浸润延伸，并可转移到其他器官组织，迅猛成倍地增长，使组织器官结构破坏，功能丧失，器官衰竭，最后导致死亡。
良性肿瘤和恶性肿瘤的区别：见表1。
恶性肿瘤的发生与发展：干细胞在体内的再生、补充过程时刻都在进行，正常的新陈代谢，使生命得以持续。新陈代谢异常，由于外界环境的变化与刺激，导致干细胞不能向下分化及增殖，而异常表达，导致细胞过度增殖、异常分化而形成肿瘤。恶性肿瘤对人本组织器官进行破坏，使其组织器官失去功能，人的生命停止。
早期发现是关键：目前，在全球没有切实可行的有效方法治疗。只能是早期发现，早期治疗。早期发现，手术切除后，及时地进行化疗。可使患恶性肿瘤患者得以生存，或延缓生命。中晚期发现，手术治疗、放疗、化疗等治疗，效果均不佳，死亡率极高。恶性肿瘤的治疗效果与发现的早晚成正比。
幻灯片的放映（以肝恶性肿瘤为例）
见图1～3。
病例讨论
通过在医院的课间实习，查房，病例讨论，加深了对恶性肿瘤的认识。以肝癌病人为例，学生们看到了患者的临床表现，找到了诊断依据。一是彩色超声诊断及CT诊断，二是胎甲球阳性。
回春术是按照宇宙“圆周运动”和“螺旋推进”理论，将人的动态形式按圆旋规则换化出有节奏的规律运动，通过这种运动形式便能激活人体细胞，达到治病、抗衰和返老还童的目标。
回春术有四个方面的内容：即一个目标，两个结合，三大特点，四个净化。
一个目标：练五环养生回春术将会使你健健康康、高高兴兴欢度120岁的自然天寿。曾老将军1986年因脑萎缩经点穴治愈后，如今96岁高龄仍兴致勃勃地准备突破百岁大关。
两个结合：
1．肌体健康与精神健康并重养练结合。2．功能运动与静态兼修养练结合。
三大特点：
1．按照宇宙“圆周运动”和“螺旋推进”本源的运动规律进行养练，就能产生治病、健身、抗衰老特效。
2．五环养生回春术可以彻底消除“亚健康”状态，并能治疗一些医学顽症，如脑萎缩、痴呆症。
3．适合各年龄段的人养练。实践证明：青少年习练后能够开发智力，在上海丰收小学实践中已证明了这一点；中青年习练可以增强体质和提高工作效率；中老年习练后可以治病抗衰老和延年益寿。
四个净化：净化肠胃，净化血液，净化细胞，净化心灵。
第一个净化肠胃：
人的大小肠全长4.5―5米，排泄较慢，肠内溶物较多，一般情况下肠中废物有1―1.5公斤，长时间存留腹中，这还包括每天的正常大便在内，因此我们每个人都应经常排毒清肠净化肠胃功能。
我们通过多次办班观察，在每次节食训练中，有35%的人排黑便，92%的人达到了减肥的效果。
闵某，男，72岁，在学习班的第4天，排出两条约10cm的黑便臭不可闻，半个月的学习体重减了8公斤。贝某，女，74岁，巩膜检查体内毒素较重，肠胃功能自觉还好，每天1、2次大便。通过辟谷第5天时，开始排出像羊粪蛋大小的硬块，随后有一更大硬物卡在内，一个多小时也未排出来，后来将牙刷把洗干净后从里撬了出来，钉当一声落在便池，仔细一看原来是一个鸡蛋大的黑色结石，经追问病史，她说年青时患过肠结核。同时左膝患骨关节炎不能伸直，走路一瘸一拐，医院要她做手术，经过数月的锻炼，膝关节也意想不到的伸直痊愈了。巩膜检查也得到了根本改变。
现在肥胖的人越来越多，给健康带来很大的危害，2004年4月办班时，30人参加学习，半个月下来，体重减得最多的10公斤，最少的2公斤，平均减9公斤。
李某，57岁，身高168cm，体重80公斤，半个月下来，体重降至70公斤。学习前每天喝两顿酒，两包烟，学习后烟酒自然戒掉了，再闻着烟酒味就不舒服。
张某，女，40岁，身高155cm，体重81公斤，通过意能点穴和练操3个月减到62.5公斤，减掉18.5公斤，颈椎病、心脏病、坐骨神经痛，下肢浮肿也好了，一年多来一直保持较好的健康体型。
第二个净化血液：
血液循环是能量物质运输的重要环节之一。我们所吃的营养物质经消化、吸收后，需要血液运送到全身每一个细胞里去。如果血液里不干净，存在杂质或毒素，就会影响健康，导致细胞提前老化萎缩。如营养过盛时就会使血液黏稠度增高，造成千万微血管阻塞，会造成中风、偏瘫。如果血液酸碱平衡失调就会造成肝、肾结石。如果你生气就会在体内产生毒素，引发疾病等。因此人的循环特别是微循环系统，医学称为人的第二心脏。前苏联一位医学家称：“几乎所有的疾病都跟微循环有关。”我们在临床发现，许多脑供血不足的人，脑内微血管都有阻塞现象，因而造成脑梗塞、脑血栓甚至脑萎缩。
董某，男，72岁，医院磁共振检查确诊为脑梗塞，出现记忆力减退，神情冷漠，流口水，行动迟缓。老伴陪他来参加学习，练操时动作不协调，回家后经老伴领着每天3、4个小时锻炼，坚持不间断苦练，奇迹终于在他身上出现了，半年后不仅练操动作协调，也爱说话，还教别人练操。去空军总院体检时，保健科主任拿着磁共振片子惊奇地发现，前后片子反复对照观察简直不敢相信自己的眼睛，原来大脑中一块硬币大小的梗塞阴影消失了。再看前列腺检查结果，原来6.2cm现在也缩回到3.8cm正常范围。董老更是高兴的合不拢嘴，逢人主动讲话，锻炼更加积极了。
郝某，男，83岁，抗战时期老干部，患心房纤颤，发作时心跳每分钟200多次，上气不接下气。还有高血压、动脉硬化等10几种病。医院交待卧床休息，当得知办班消息后，他毅然决定要参加学习，全家十几口人都反对，最后谁也没说服他，女儿只好带着氧气瓶陪他来参加学习。到了养生基地当即吸了六袋氧气，随即马上给老人点穴治疗，当晚睡了一个好觉。第二天起床感到一切良好，他就跟大家一起上课和锻炼。两天后他感觉到全身都很轻松，就把所有药停了，每天在大院里散步，几次散步加起来2公里，连续半个月的学习锻炼，身体发生了明显的变化，杂志社记者来采访感叹不已。学习结束后和女儿高高兴兴回家，半年后领着老伴再次来学习了一个月。
第三个净化细胞：
细胞是人体组织的基本单位，细胞健康与否直接关系到身体健康和生死存亡。什么样的体质才算健康呢？一般认为细胞无病理病化，生理功能旺盛，精神状态良好，耐疲劳，有活力才算真正健康的体质。
如果细胞出现老化或萎缩，这是医学认为不可逆转的顽症。笔者通过实践观察，细胞萎缩经治疗可以复苏，如曾老将军1986年因脑萎缩影响到正常生活，经过半年多的意能点穴和锻炼奇迹般的恢复了健康。董老经过半年的锻炼，脑萎缩和脑梗塞得到了治愈，肖记者牙龈萎缩，牙已松动，经过半年的锻炼长出满口鲜嫩的牙龈来，白发也变黑了。张老师头面部老年斑较多，经过半年的锻炼，成块的老年斑脱落下来，这些都是人体细胞发生根本变化的结果。
凡是参加学习，经过数月的锻炼后，全身细胞活力都会增强，面部皮肤焕发出青春的光泽，显得年青有精神。
第四个净化心灵：
净化心灵就是人的心理要健康，心灵美。世界卫生组织提出亚健康一词后，又提出了精神健康。精神又体现在人的心情、情绪上面，人的健康与心情密切相关，一切着急、上火、担心、牵挂、害怕、生气、发怒等等不安心情都会影响健康。
【关键词】胃癌；干细胞；PI3K；Akt
doi：10.14033/ki.cfmr.2017.2.084文献标识码B文章编号1674-6805（2017）02-0154-02
胃癌属于普外科常见的恶性肿瘤，源于胃黏膜上皮细胞[1]。研究发现，肿瘤是一种信号通路疾病。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）是参与肿瘤发生发展的重要细胞信号通路，因此抑制该信号通路成为胃癌靶点治疗和预防转移和复发的关键[2-3]。但目前PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中的表达研究罕见报道。本研究通过收集胃癌切除术患者胃癌组织标本，应用肿瘤球悬浮分选法从组织标本中分选出胃癌干细胞和普通肿瘤细胞，比较两组细胞PI3K、Akt的蛋白及mRNA表达量，以期能够为胃癌的预防和治疗提供新的依据和策略，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
收集笔者所在医院普外科胃癌切除术患者胃癌组织标本40例。患者年龄为28～53岁，平均（39.5±6.1）岁，所有患者均为首次确诊，均未接受过放疗或化疗，无其他肿瘤病史，无内分泌疾病。CD44、PI3K、Akt抗体均购自美国Abcam公司。小鼠抗人GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2试验方法
胃癌干细胞的原代培养、分化及鉴定：应用肿瘤球悬浮分选法分选组织标本中胃癌干细胞。具体方法为，先用常规方法对组织标本进行脱蜡水化，使用微波炉对组织进行抗原修复，将组织中的坏死组织和血管剔除干净，清洗标本（D-Hank’s液）。将组织标本剪碎，再将其消化（胰酶），终止消化后，在离心机中离心，弃上清，将细胞收集、重悬，在其中加入超微磁珠（CD44阳性包被），充分混匀后，将分离株安装于磁场之上，将分选获得的细胞置于含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子及b27的干细胞培养基中。培养箱的参数设置为：37℃，5%CO2，饱和湿度。使用CD44+对胃癌干细胞进行标记，使用免疫荧光染色对胃癌干细胞进行鉴定，阳性表达即可以认为其为胃癌干细胞，染色结果为阴性表达则为普通胃癌细胞。
1.3实时荧光定量PCR检测两组细胞PI3K、Akt基因的mRNA表达水平
两组细胞的总RNA使用Trizol法提取，内参对照为GAPDH，（PI3K、Akt及GAPDH引物均由苏州金唯智生物科技公司合成）。对总RNA进行逆转录和RT-PCR扩增，荧光定量PCR仪为美国ABI公司，7500型。选用20μl为扩增体系，试验反应条件：95℃、5min循环1次；95℃、20s，60℃、40s，循环40次；以0.5℃从65℃逐渐递增至95℃。按照2-CT计算Notch1mRNA的相对表达量，每组均设3个复孔，均进行3次重复试验。
1.4Westernblot检测两组PI3K、Akt的蛋白表达
收集两组细胞，使用常规方法提取总蛋白，储存在-80℃冰箱中。取总蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，冰浴下以80V电压转至PVDF膜，时间为1.5h。PBST缓冲液洗膜3次后，封闭1.5h。剪膜后加入一抗，4℃孵育过夜，兔抗人PI3K抗体、兔抗人Akt抗体的稀释比例均为1∶1000。第2天进行复温，使用PBST摇摆清洗3次后，加入二抗，室内温度条件下孵育60min。条带结果用凝胶成像分析系统对其进行收集，量化分析用ImageJ软件进行处理。
1.5统计学处理
用SPSS17.0对数据进行分析处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P
2结果
2.1实时荧光定量PCR检测两组细胞PI3K、Akt基因的mRNA表达水平
RT-PCR检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的mRNA相对表达量分别为0.680±0.122和0.513±0.121，明显高于普通胃癌细胞组的0.235±0.086和0.205±0.069，差异有统计学意义（P
2.2Westernblot检测两组PI3K、Akt的蛋白表达
Westernblot检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的蛋白相对表达量为0.771±0.206和0.601±0.182，明显高于普通胃癌细胞组的0.215±0.012和0.218±0.028，差异有统计学意义（P
图1Westernblot检测两组PI3K、Akt的蛋白表达
3讨论
胃干细胞是具有自我更新、无限增殖、定向分化能力的细胞。一旦胃干细胞的基因发生突变或者微环境发生改变时，就会出现增殖不受调控的干细胞，向肿瘤干细胞发生转变，引起胃癌的发生[4]。PI3K信号通路在肿瘤的发生、发展上起着重要的调节作用，具有抑制凋亡、促进增殖的关键作用[5]。在乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、成神经管细胞瘤等多种人类肿瘤中，均发现有PI3K信号通路的异常活化[6-8]。
对PI3K信号通路进行深入研究，对胃癌的\断及治疗有着深远的意义[9-11]。早期胃癌、中晚期胃癌中PI3K蛋白和Akt蛋白的阳性表达率均较正常胃黏膜组织高，表明PI3K、Akt与胃癌的形成和恶性进展有关，可能主要通过促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡起作用。程玉等[12-13]研究发现，抑制PI3K活性可诱导凋亡的发生。PI3K/Akt通路在胃癌细胞的生长、增殖及转移、侵袭表达方面都具有重要的作用[14]。本课题组推测PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中可能存在异常表达。本次研究中，通过肿瘤球悬浮分选法分选组织标本中的胃癌干细胞，并进行鉴定均呈阳性表达CD44。通过与普通胃癌细胞比较，发现RT-PCR检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的mRNA相对表达量为分别为0.680±0.122和0.513±0.121，明显高于普通胃癌细胞组的0.235±0.086和0.205±0.069，差异有统计学意义（P
综上所述，PI3k/Akt信号通路在胃癌干细胞中高表达，表明它可能参与了胃癌的发生发展。
参考文献
[1]赖斌，朱陪谦.PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中的表达研究进展[A].江西省中西医结合学会.江西省2014年中医、中西医结合肿瘤学术交流会暨部级中医药继续教育项目―中医药治疗肿瘤新进展培训班论文汇编[C].江西省中西医结合学会，2014：3.
[2]陈浩，许浪.信号通路对胃癌干细胞及胃癌发生的影响[J].中国组织工程研究，2013，14（10）：2532-2537.
[3]陈建新，陈雄，欧阳学农，等.胃癌干细胞的研究进展[J].临床肿瘤学杂志，2013，18（10）：952-956.
[4]陈建新，王均惠，彭永海，等.胃癌干细胞的研究现状及发展方向[J].中华肿瘤杂志，2014，36（11）：801-804.
[5]牛磊，郗洪庆，陈凛，等.Lgr5-Wnt/β-catenin信号通路与胃癌干细胞的研究进展[J].医学院学报，2014，35（12）：1268-1272.
[6]李霞，徐桂芳，张伟杰，等.胃癌干细胞的分离鉴定以及干细胞特性研究[J].胃肠病学，2014，10（9）：517-522.
[7]隋华，付晓伶，潘树芳，等.PI3K/Akt/NF-κB通路调控ABCB1/P-gp介导的人结肠癌细胞多药耐药的研究[J].中国癌症杂志，2014，10（2）：106-111.
[8]刘姣，李明春.PI3K/Akt通路与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性的关系研究进展[J].中国药理学通报，2013，29（12）：1648-1650.
[9]孙栋勋，蔡志毅.EGFR/PI3K/Akt细胞信号传导通路与肿瘤[J].检验医学，2014，10（7）：768-773.
[10]解友邦，李建平，冯建明，等.PI3K/Akt信号转导通路和肿瘤[J].国际呼吸杂志，2015，35（19）：1502-1505.
[11]沈存思，范方田，陶丽，等.抑癌基因PTEN与肿瘤血管生成研究进展[J].中国药理学通报，2013，29（5）：597-600.
[12]程玉，李建玲，刘海旺，等.PI3k/Akt蛋白及mRNA在60例胃癌中的表达及意义[J].重庆医学，2015，7（10）：1352-1354，1357.
[13]姜蓬垒，常冰梅.PI3K-Akt信号通路与肿瘤化疗耐药性[J].国际肿瘤学杂志，2014，41（5）：324-327.
全文包括以“患者手记”形式介绍的成功治疗经验，读后会让您感同身受；其后的“专家共识”，帮您解读这种成功经验背后的理论依托；最后的“延伸服务”，介绍胰岛素笔和胰岛素泵，为您提供具体的贴身帮助。
2型糖尿病患者不要拒绝胰岛素
徐芳玉
我是一名退休医生，今年74岁，4年前我被确诊为2型糖尿病。当时的空腹血糖为14.1毫摩尔/升，尿糖+++，尿蛋白++，肌酐也高出许多，并且每天清晨面部都有轻度浮肿。种种迹象表明，我已出现了糖尿病肾病并发症，病情相当严重。
在专业医生的指导下，我严格按照糖尿病综合治疗原则，调整饮食、适量运动、保持乐观情绪，并配合足部按摩（文见本期61页“不妨一试”栏目）。在药物治疗方面，我没用任何口服降糖药，只用诺和灵30R胰岛素，早餐前16个单位，晚餐前12个单位。治疗一周后，空腹血糖降至6.1毫摩尔/升，尿糖消失，尿蛋白由++降为+。第2周尿蛋白转阴，面部浮肿消失。一年后减少了胰岛素用量，各项指标仍在正常范围。如今我用胰岛素已近4年，每月检查空腹血糖一般不超过7，餐后2小时血糖一般不超过8，糖化血红蛋白只有5.5%，再未出现新的并发症，原先的将军肚、脂肪肝也没了。
我很庆幸自己发现糖尿病后及早使用了胰岛素治疗，不但有效控制了血糖，还遏止了糖尿病肾病的发展，从而避免了肾衰的严重后果。如今我不但过着正常人的生活，退休后还一直在发挥余热，晚年生活充实而快乐。
2型糖尿病患者早用胰岛素效果好
中山大学附属三院副院长、主任医师翁建平教授在国际权威医学杂志《柳叶刀》上撰文说，传统的2型糖尿病治疗是采取从饮食、运动到单药口服，再到联合口服的阶梯式疗法。然而，迄今为止还没发现任何一种口服降糖药能够改变2型糖尿病患者胰岛β细胞功能衰退的进程。相反，约有半数以上患者由于长期药物刺激而导致胰岛β细胞功能衰竭，致使血糖难以控制。而长期的高血糖毒性，无疑增加了并发症的风险。研究显示，早期对2型糖尿病患者进行强化胰岛素治疗，其效果明显好于传统的治疗方法。
天津医科大学代谢病医院谢云教授认为，2型糖尿病早期以胰岛素抵抗为主。随着病情进展，逐渐出现β细胞数量减少，直至功能衰竭。早期应用胰岛素，可让β细胞稍事休息，从而保护其功能，使患者尽快达到良好的血糖控制，消除高糖毒性，延缓并发症的发生。因此，临床上不应将胰岛素治疗作为口服药物治疗失败后的最终手段。
美国劳森司托（Rosenstock）教授和英国的侯姆（Home）教授同样认为，目前所能用的口服降糖药降糖能力有限。因此，相当多的2型糖尿病病人最终需要接受胰岛素治疗。而尽早使用胰岛素，不仅有利于控制血糖达标和防治并发症，而且对保存β细胞功能有益。
中山大学附属二院主任医师程桦教授指出，2型糖尿病患者用胰岛素并非终身制。
其实，2型糖尿病患者用胰岛素可以是短期的，也可以是长期的。一部分患者血糖恢复正常后，可改用较少品种和较小剂量的口服降糖药。对于口服降糖药失效的患者，短期胰岛素强化治疗后，部分患者可能恢复口服药物的治疗效果。只有胰岛β细胞功能很差的患者，才需要长期胰岛素治疗。因此，当医生认为2型糖尿病患者需要用胰岛素时，患者应该理解并积极配合。
帮您了解胰岛素笔和胰岛素泵
第二军医大学长海医院教授张家庆
胰岛素笔是一种形状似笔的胰岛素注射器，由笔和笔芯两部分组成。笔芯依胰岛素的种类而异，可按需要购买，用完后无须换笔，只换笔芯即可。笔芯内的胰岛素可直接注入皮下，省去了从瓶内抽取再注射的麻烦。胰岛素的剂量可通过控制笔尾部的推杆向前推动的距离来掌握，剂量直接以单位的形式显示在尾部的窗内。笔的针头特别细，可以达到基本无痛。针头为一次性，用完要及时更换。
如果医生建议您用胰岛素，您可要求使用胰岛素笔。
胰岛素笔不但注射剂量精准、无痛，而且操作简单容易，特别是外出旅游随身携带十分方便。
类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一种以进行性、侵蚀性关节破坏为特征性病理改变的全身性自身免疫病。其基本病理改变主要是滑膜慢性炎症及关节软骨和骨质的破坏，临床特征为关节结构的炎症和肿胀、慢性进行性病程，并可致多个关节完全强直，最终导致功能的丧失，致残率高［1］。因此，为临床发病机制的研究及寻找新的诊疗手段，建立一种能准确模拟RA发病过程的动物模型尤为重要。目前，最为常用的RA模型为Ⅱ型胶原诱导的小鼠或大鼠模型，但其建模过程需要通过尾静脉注射Ⅱ型胶原和佐剂的混合物，操作难度大［2］。降植烷是一种常用的致炎剂，有文献报道其能不依赖于T或B细胞激活免疫系统引起免疫反应［3，4］。本文以BALB/c小鼠为研究对象，拟制备降植烷诱导的RA小鼠模型并对其免疫病理变化进行评价。
1材料与方法
1.1实验动物及分组6～8周雌性BALB/c小鼠30只，体质量25～30g，由苏州大学实验动物中心提供。采用随机数字表法分为模型组及对照组，每组15只。SPF级动物房常规饲养。实验方案得到苏州大学附属第一医院动物伦理委员会批准。
1.2主要试剂降植烷，即2，6，10，14-四甲基十五烷，购于美国Sigma公司。PE标记抗小鼠抗体CD11b、CD11c、Gr1，FITC标记CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)，APC标记抗小鼠抗体B220均购置美国eBioscience公司。
1.3降植烷诱导RA小鼠模型的制备小鼠适应性饲养1周，造模组于0周、9周、18周时腹腔各注射0.5ml降植烷;对照组于相同时间腹腔注射0.5ml生理盐水。第21周时，采用颈椎脱臼法处死小鼠，保留小鼠脾脏及双侧后肢关节，分别行免疫学及组织病理学检测。
1.4小鼠足趾厚度的测定从第18周起，使用游标卡尺对小鼠同侧的后足跗跖关节肉厚处进行测量，每周测量2次，每次重复测量3次，取平均值。所有测量由两名实验者独立完成。
1.5关节炎指数评分(Arthritisindex，AI)从第18周起，对各组小鼠关节肿胀程度进行评分，每周评测2次，每次重复测量3次，取平均值。采用关节炎评分法(0～4分)［5］，0分:无关节炎;1分:有红色斑点或轻度肿胀;2分:关节部位中度肿胀;3分:严重肿胀;4分:严重肿胀且不能负重，四肢评分的和即为关节炎指数(最大分数16)。
1.6流式细胞检测脾细胞免疫分子表达变化取小鼠脾脏制成单细胞悬液，5×105个细胞加入各流式分析管，分别加入PE标记抗小鼠抗体CD11b、CD11c、Gr1，FITC标记CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)，APC标记抗小鼠抗体B2204℃避光孵育1h，经洗涤，1%多聚甲醛固定，流式细胞仪分析细胞的免疫分子在脾脏细胞中的表达情况。
1.7组织学观察小鼠处死后切取后肢膝关节，剔除皮毛和肌肉浸泡于4%甲醛溶液固定3d，而后放入10%EDTA液中脱钙30d，常规石蜡包埋，4μm切片，H＆E染色，普通光镜观察。1.8统计学处理所有实验数据以x±s表示，SPSS16.0统计软件处理数据。采用t检验进行统计学分析，分析前所有数据均进行方差齐性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1小鼠一般情况造模期间，小鼠无死亡。正常组小鼠精神状态好，能正常爬行，关节活动自如，无红肿;第三次注射免疫(18周)后，造模组有11只小鼠出现症状(成模率73.3%)，具体表现为足爪红肿，体型消瘦，毛色杂乱稀疏，步态异常，倦怠易激惹;足部存在不同程度肿胀，关节增粗，黏膜红肿渗出。见图1。小鼠足掌厚度测量结果显示，21周时模型组小鼠后足肿胀最为明显，厚度为(2.90±0.51)mm，与对照组(1.29±0.47)mm比较，差异有统计学意义(t=－6.097;P＜0.05);关节炎评分结果显示21周时11只成模小鼠中，有4只症状较轻，7只发病严重，关节炎指数为9.55±2.80。
2.2组织病理学观察正常小鼠膝关节结构完整无损，无骨小梁吸收，关节软骨光滑平整(图2A)。模型组小鼠膝关节结构被破坏，有骨小梁吸收，关节软骨可见坏死脱落，纤维化，关节腔狭窄。炎细胞大量浸润，伴有程度不同的软组织水肿。
2.3小鼠脾细胞流式细胞检测结果21周时取脾脏制成单细胞悬液，荧光抗体标记后经流式细胞仪检测，结果显示，模型组脾脏细胞中CD11b、CD11c和GR1表达明显增加，提示吞噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞亚群数量增加(表1，P＜0.05)。模型组中T细胞表面的表面标志CD4、CD8、CD154均有不同程度的增高，与对照组比较差异有统计学意义(表2，P＜0.05)。模型组和对照组脾脏细胞中B220及CD21、CD23、CD80、CD86的表达未有明显差异(P＞0.05，结果未列出)。
3讨论
类风湿性关节炎是一种累及全身关节的自身免疫性疾病，其病理特征是慢性炎细胞浸润和滑膜增生，最终导致关节软骨和骨质破坏［1］。迄今为止，RA发生的确切机制尚不清楚，还没有有效的预防和治疗方法，所以，建立一种能够准确模拟人类RA发病过程的动物模型对研究RA病因及药物治疗至关重要。降植烷，即2，6，10，14-四甲基十五烷，是叶绿素分解后的产物。有学者发现降植烷能促进小鼠B淋巴细胞瘤的发生，而将降植烷经腹腔注射后能诱导产生狼疮特异性抗体，实验小鼠表现出明显的系统性红斑狼疮的特征。在本研究中，笔者将0.5ml降植烷经腹腔注射给BALB/c小鼠，并在9周和18周时各补注1次，21周时实验小鼠表现出明显的关节炎症状，发病率为73.7%，与Potter等［10］报道一致。组织学染色发现，实验小鼠关节滑膜增生明显，有大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞和单核细胞为主，软骨和骨组织破坏明显，有血管翳形成，与人类RA患者病变关节组织病理改变类似。汪婷婷等［4］在降植烷诱导的大鼠关节炎模型中也发现了类似的病理改变。上述结果提示经腹腔注射降植烷能够诱导小鼠产生关节炎病理改变。
有研究表明，T细胞尤其是CD4+T细胞在RA发病过程中起重要作用。在RA滑膜浸润的单核细胞中，30%～50%为T细胞，而且这些细胞多处于活化状态，并且通过与巨噬细胞相互作用，引起软骨和骨组织破坏。笔者研究发现，降植烷免疫后的小鼠脾脏中CD4、CD8和CD154+T细胞数量明显增多，提示降植烷可能通过调节T细胞引起小鼠关节炎病理改变。Holmberg等的研究表明降植烷是一种非免疫原性的佐剂，不能被T细胞或B细胞特异性识别，降植烷致关节炎的能力也就取决于其对免疫系统的非特异性刺激引起的自身反应性T淋巴细胞活化，引起关节急性炎症，随后进入慢性进展和反复发作阶段。因此，在免疫学特征方面，降植烷诱导的RA模型可能更类似于RA患者，更适于RA病理机制的研究。B细胞在RA关节滑膜中的数量较少，但近年来的研究发现B细胞在RA发病机制中起重要作用。
[关键词]杨梅素；肝肿瘤细胞；HepG2；凋亡
[中图分类号]R735.7[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2012）12（c）-0007-03
[Keywords]Myricetin；Livercancercell；CelllineHepG2；Apoptosis杨梅素（myricetin，MYR）是从天然植物藤茶（葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物）、杨梅等树皮中提取得到的多羟基黄酮类单体化合物，主要存在于杨梅的树皮中，其中嫩叶茎叶中含量较高，具有显著的生物活性，如抗肿瘤、降低神经毒性、影响淋巴细胞活化和增殖、拮抗血小板活化因子（RAF）、抗氧化抗衰老、保肝退黄以及降血糖等作用[1]。其中，杨梅素在抗肝肿瘤方面的作用日渐备受关注[2-6]。近年来，国内不少学者对其抗肝癌作用机制方面做了大量的总结和研究[5-6]，主要是介绍杨梅素能有效诱导肿瘤细胞的凋亡，然而，由于研究并不深入，未能从分子生物水平上阐释杨梅素的抗肿瘤机制。本文通过甲基噻唑蓝（MTT）法对细胞增殖活力进行检测、倒置相差光学显微镜下观察荧光染色细胞生长形态、AnnexinV-PI流式检测HepG2的细胞生长周期以及进一步的DN段电泳等实验，表明杨梅素通过影响肿瘤细胞HepG2的生长周期诱导细胞凋亡从而发挥其抗肝癌作用，并深入揭示起作用机制与激活Caspase家族蛋白直接相关。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器OlimpusCKX41临床型倒置显微镜，德国MACSQuantTM流式细胞仪，上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-IⅡ型CO2细胞培养箱。
1.1.2试剂及耗材人类肝癌细胞HepG2（购于广州市中山医科大学病理科），小牛血清（购于广州蕊特生物科技有限公司），杨梅素（由广州市中山大学药学院制备并提供，HPLC纯度高于95%），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（包括Caspase-3和Caspase-9）以及DNA引物试剂（均购于美国CST生物工程有限公司），RPMI1640和DMEM培养基（购于上海阳光生物技术有限公司），96孔培养板（购于广州市华粤行有限公司）。溴化乙锭、磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）、二甲亚砜（DMSO）、琼脂糖、MTT等其他试剂，均为分析纯，购于广州化学试剂厂。
1.2方法
1.2.1杨梅素溶液的制备取杨梅素纯品适量，精密称定，用0.1%DMSO溶液溶解并稀释至杨梅素浓度为100μmol/L；临用时DMEM培养液稀释。
1.2.2MTT法检测细胞死亡率和细胞增殖活力以7000/孔的密度接种于96孔板，每孔180μL，培养过夜，静置，分别加入10μL由0～60μmol/L不同浓度的杨梅素单体化合物溶液，并设置阴性对照组。药物作用48h后培养结束前4h加入MTT，继续培养4h后倾去培养液，加入DMSO100μL使溶解、显色，用酶联仪以570/630双波长测定，以杨梅素浓度（μmol/L）为横坐标，细胞死亡率（%）为纵坐标，绘制杨梅素对HepG2细胞增殖影响的曲线图，并利用Bliss法算出细胞抑制生长率达50％时的杨梅素的药物浓度，以IC50值表示。
1.2.3荧光染色细胞形态观察从MTT法检测细胞死亡率的结果中，选定一定浓度的杨梅素单体化合物溶液。以100000个/孔的细胞密度接种于6孔板（具有玻片）中，培养24h后，加入选定浓度的杨梅素溶液，作用不同时间（分别为即刻和24h），用带电子拍摄功能的倒置荧光显微镜观察活细胞生长情况并记录。
1.2.4流式细胞术（FCM）分析迅速收集由30、50μmol/L不同浓度杨梅素作用下的HepG2细胞，每个浓度约收集10000个。用70%（V/V）的冷乙醇适量置4℃下固定24h，PBS洗2次，1g/LRNA酶A37℃消化30min，100mg/L溴化乙锭染色20min，用流式细胞仪测定分析不同浓度的杨梅素单体化合物作用下的各期细胞比率及凋亡率。利用流式细胞仪专用分析工具软件进行数据处理[数据以均数±标准差（x±s）表示，并进行统计学分析]。
1.2.5Western印迹法观察蛋白质片段不同浓度的杨梅素处理后，收集悬浮和贴壁的HepG2细胞，以转速1000r/min离心10min，PBS清晰3次，用细胞裂解液与2℃冰浴裂解超过1h，再以15000r/min离心5min，收集上清液。通过Bio-Rad法蛋白质定量处理后，以SDS-PAGE凝胶电泳，后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，二抗封闭后以氨基联苯胺显色，扫描并记录。
2结果
2.1MTT法细胞死亡率和细胞增殖活力检测结果
杨梅素单体化合物对HepG2细胞有明显的生长抑制作用，通过Bliss法测得杨梅素作用48h后其IC50值为（32.18±2.31）μmol/L。由结果可知，细胞死亡率随杨梅素单体化合物的浓度的增加而增加。见图1。
2.2荧光染色后细胞形态变化结果
60μmol/L的杨梅素溶液作用前，细胞核表面光滑且具有均匀的荧光；而作用24h后，细胞数目变少且形态变圆，细胞核皱缩和坏死细胞碎片清晰可见，荧光浓染致密，核膜边缘呈现新月状小体，具有典型的细胞凋亡特征，见图2、3。
2.3杨梅素对HepG2细胞株细胞比率及凋亡率的影响
使用流式细胞仪利用PI染色法观察杨梅素对HepG2细胞株的细胞周期影响，结果表明，不同浓度杨梅素溶液显著影响HepG2肝癌细胞的细胞周期，其作用于HepG2细胞24h后，与阴性对照组比较，G2/M期细胞比率明显增高，G0/G1期和S期细胞比率降低，差异均有统计学意义（均P
2.4细胞周期相关蛋白CyclinB1、p34cdc-2蛋白表达量变化结果
三种不同浓度的杨梅素溶液作用于HepG2细胞24h后，p34cdc-2蛋白的表达量未见变化，而CyclinB1蛋白的表达量明显上升，且呈现浓度依赖关系。见图4。
2.5不同浓度的杨梅素溶液对凋亡机制相关蛋白PARP和Bcl-2表达量的影响
不同浓度（0、30、50μmol/L）的杨梅素溶液作用于肝癌细胞HepG2细胞24h后，Bcl-2蛋白的表达量锐减，并诱导半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的底物PARP蛋白（113kD）水解为89kD的特异性水解产物。见图5。
3讨论
笔者通过多方面的试验数据证实，天然黄酮类化合物杨梅素对肝癌细胞HepG2细胞有生长抑制作用，并呈现良好浓度依赖关系。其中，流式细胞仪测定细胞凋亡率的结果表明，杨梅素对HepG2肝癌细胞的阻滞在G2/M期。另外，由Western印迹法检测推断，杨梅素通过增加CyclinB1蛋白的表达量从而使HepG2肝癌细胞无法于分裂后期脱离，进而将其抑制于细胞G2/M期，结果与AnnexinV-PI流式凋亡检测结果吻合。而在影响细胞周期的过程中p34cdc-2蛋白的表达量未见显著增加或减少，正是这一结论的佐证。
Caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶，能特异性裂解天冬氨酸残基，在细胞凋亡信号传到中起着至关重要的作用。根据它在级联反应中的作用可分为线粒体途径和死亡受体途径。前者受线粒体内膜释放的细胞色素C的调控，而细胞色素C受凋亡相关蛋白Bid、Bax和抗凋亡蛋白Bc1-2，Bc1-XL等的调节，凋亡信号最终导致Caspase-9前体活化成Caspase-9，进一步激活下游的Caspase-3，最后降解底物如PARP，导致细胞凋亡。后者最终引起Caspase-8的活化，再直接作用于Caspase-3，使Caspase-3激活，从而诱导细胞凋亡[7-13]。而图5显示底物PARP降解和抗凋亡蛋白Bcl-2锐减的现象，因此笔者推断杨梅素的诱导HepG2肝癌细胞凋亡可能的作用机制为：参与线粒体途径的调控，通过活化Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白（如Bak、Bax等）使线粒体外膜通透性增加，进而激活Caspase-3，使其底物PARP水解，DNA产生片段化最后完成HepG2细胞凋亡过程。为使其得到进一步的证实，笔者认为接下来的研究可通过引入Caspase-3和Caspase-9抑制剂，尝试干预杨梅素影响线粒体途径的调控，并检测其量效关系。
[参考文献]
[1]张秀娟，黄清玲，季宇彬.杨梅素的药理活性研究进展[J].天津药学，2008，20（5）：57-59.
[2]韦伟，姜庆.杨梅素诱导膀胱癌细胞株BIU-87凋亡机制研究[J].重庆医科大学学报，2010，35（120）：1791-1794.
[3]张晓宏，邹祖全，徐琛炜，等.杨梅素对人肺腺癌细胞增殖的影响及其机制[J].营养学报，2010，32（2）：162-164.
[4]OngKC，KhooHE.Biologicaleffectsofmyricetin[J].GenPharmacol，1997，29（2）：121-126.
[5]俞瑜，曾耀英，刘良，等.杨梅素对淋巴细胞活化及增殖的影响[J].中国药理学通报，2006，22（1）：63-66.
[6]郑玲，荆瀛黎.杨梅素诱导人肝癌HepG2凋亡机制研究[J].中国现代药物应用，2009，3（10）：1-3.
[7]王秀英，冷水龙.小白菊内酯增强肝癌HepG2细胞对顺铂敏感性的实验研究[J].实用医学杂志，2011，27（2）：177-180.
[8]杜宏，张娜，高霞，等.莲房原花青素对人肝癌细胞HepG2生长及凋亡的作用[J].实用医学杂志，2008，24（6）：891-893.
[9]李璐，毕富勇，吕俊.银耳多糖诱导肝癌HepG-2细胞凋亡的研究[J].实用医学杂志，2009，25（7）：1033-1035.
[10]隋春阳，李嘉，胡勇，等.TLR4受体在肝癌细胞株HeG-2的表达[J].中国医药导报，2008，5（18）：19-20.
[11]张玉碧，吕林华，吕立华.大蒜素联合索拉菲尼对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及机制[J].中国医药导报，2011，8（15）：45-46.
[12]杨春光，弓晓杰，孙长滨.人参皂苷化学修饰物PM1诱导肝癌HepG2细胞凋亡[J].中国医药导报，2009，6（3）：21-22.
【关键词】重度烧伤；淋巴细胞；免疫；凋亡
【Abstract】Objective：ToobservethechangesoflymphocyteinsevereburnpatientswiththetreatmentofPidotimod.Method：30severeburnpatientswererandomlydividedintotwogroups.TheobservergroupwastreatedwithPidotimod.ThecontrolgroupwastreatedwithoutPidotimod.Theperipheralvenousbloodsamplesofthepatientswerecollectedondays1，7，14，and21aftertheburn.Thenumberofthelymphocytewasobserved.CD4+，CD8+lymphocyteanditsapoptosisrateweredetectedbyflowcytometry.Thedurationsofthecureofthepatientswereobserved.Result：Therewerenosignificantdifferencesbetweenthetwogroupsonthelymphocyte，andthenumberofCD4+，CD8+anditsapoptosisrateonthe1dayaftertheburn.Butthenumberoflymphocyte，CD4+，CD8+，andCD4+/CD8+ratiooftheobservergroupwassignificanthigherthanthatofthecontrolgroup（P
【Keywords】Severeburn；Lymphocyte；Immunology；Apoptosis
First-author’saddress：The264thHospitalofthePLA，Taiyuan030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.020
烧伤可导致机体免疫功能紊乱，严重的烧伤程度、过度的急性炎症反应会导致机体出现免疫抑制，这会使外周循环中淋巴细胞数目明显减少，即使存活淋巴细胞大部分也处于克隆无反应状态，甚至凋亡[1]。免疫细胞凋亡异常是导致免疫抑制、免疫重要原因[2]，致使机体无力抵抗外界微生物的侵袭，甚至发生烧伤脓毒血症，危及患者生命。如何尽快改善这种免疫紊乱是防治烧伤感染、提高大面积患者治愈率的一个重要环节[3]。笔者尝试使用口服匹多莫德对重度烧伤患者进行免疫调控，探讨该药物对烧伤患者免疫调节的作用，评价其临床疗效。
1资料与方法
1.1一般资料选取2009年2月-2013年11月严重烧伤6h内入264医院烧伤重症监护室（BICU）的重度烧伤患者30例（TBSA30%～50%），其中Ⅲ度烧伤小于10%，无吸入性损伤，性别不限，年龄16～50岁，排除原有心、肺、肝、肾等基础疾病。研究计划经本院伦理委员会讨论通过，患者或家属均签署知情同意书。入选的30例患者，男25例，女5例，年龄16～50岁，平均（30.2±8.9）岁；烧伤面积30%～50%，平均（40.3±7.2）%。两组患者性别、年龄及烧伤面积比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2研究设计入选患者随机数字表法分为对照组和治疗组，每组各15例。入选患者均在入院即给予生命体征监护和相应支持治疗，根据烧伤面积、体重，按照三医大公式复苏补液，其余烧伤治疗方法两组基本相同，治疗组接受匹多莫德0.8g，2次/d，口服；持续给药30d。对照组未使用匹多莫德，所有患者分别于烧伤后24h内，7、14，21d凌晨6h留取空腹静脉血标本进行检测。同时观察患者临床愈合天数。
1.3免疫功能指标检测（1）外周血T细胞分离，采用含二胺四乙酸二甲（EDTA）的无致热源试管（湖北金杏公司）收集血标本3mL，与同体积无菌等渗盐水混合均匀，置于聚蔗糖-泛影葡胺液面上，18～20℃、1500转离心20min，吸取第2层云雾状单个核细胞层，离心洗涤后，去除红细胞，进一步分离纯化淋巴细胞；（2）将获取的外周血单个核细胞浓度用磷酸盐缓冲液（PBS）调整为1×106个/mL，吸取100μL加入流式管内，加入CD4+异硫氰酸荧光素（FITC）20μL、CD8+别藻蓝素（APC）20μL，避光混匀15min后，加入
400μLPBS，流式细胞仪检测CD4+、CD8+（荧光标记抗体、细胞溶解剂均和流式细胞仪均为美国BDPharmingen公司产品）。CD4+、CD8+细胞凋亡率检测：采用PBS将分离好单个核细胞浓度调整为1×106个/mL，离心弃上清，用0.1mL结合缓冲液将细胞沉淀悬浮于流式管中，加入CD4-FITC20μL，CD8-APC20μL，膜联蛋白V5μL和7-氨基放线菌素D5μL，避光孵育15min，加入结合缓冲液，1h内流式细胞仪检测。采用日本产Sysmex1000i血细胞分析仪计数外周血淋巴细胞。
1.4统计学处理使用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，组间差异采用方差分析，P
2结果
2.1免疫功能指标的变化两组烧伤后淋巴细胞前14天均呈下降趋势，21d、30d时淋巴细胞数目呈上升趋势，治疗组较对照组淋巴细胞波动较平缓，24h、3d两组比较差异无统计学意义；7d、14d、21d两组比较差异有统计学意义（P
2.2临床治愈时间治疗组临床愈合时间平均（28.8±3.2）d，对照组为（26.2±4.1）d，治疗组较对照组短，但比较差异无统计学意义。
3讨论
重度烧伤患者的早期，免疫细胞分泌大量的炎性介质，中性粒细胞及巨噬细胞等免疫细胞参与急性炎症反应，淋巴细胞参与非特异性自然免疫，然而机体并非处于一成不变炎症激活状态。随着病程的发展，机体逐渐进入免疫抑制阶段，因大面积烧伤致使淋巴细胞对特异性抗原刺激无增殖反应并且细胞因子生成明显受到抑制，表现为淋巴细胞增殖能力下降，淋巴细胞处于克隆无反应状态。同时，抗原特异性T、B淋巴细胞的被清除或失活。凋亡是诱发T淋巴细胞减少的主要原因[4]，此时，辅T细胞（Th）减少，而抑制性T细胞（Ts）相对增多，CD4+/CD8+比例下降，免疫功能缺陷，进一步增加患者易感性，这一阶段患者易发生脓毒症。细胞凋亡在脓毒症器官损伤、免疫失衡等方面发挥了重要作用，对脓毒症的预后有重要影响[5-8]。有研究表明，脓毒症时患者除大量淋巴细胞凋亡外，抗原呈递细胞也发生了凋亡，从而使免疫细胞不能有效的克隆增殖，虽然此时NK和巨噬细胞数量改变不大，但是由于CD4+、B细胞和树突状细胞大量凋亡，NK和巨噬细胞缺乏有效地免疫刺激，处于活性抑制状态，因此机体不能对病原体产生有效地免疫应答[9]。笔者临床观察中也发现，重度烧伤后淋巴细胞数目在7d内持续下降，14～30d时才缓慢上升，而淋巴细胞上升快的患者，愈合速度较快。而淋巴细胞作为机体主要的免疫细胞，其凋亡失控，可使机体的免疫系统紊乱，从而导致疾病的发生发展[10]。这提示，免疫调节治疗在是重度烧伤治疗中应处于中心地位。
免疫调理用于重度烧伤患者的药物很多，包括胸腺肽、谷氨酰胺等，匹多莫德作为免疫调节剂已广泛应用于多种疾病的治疗[11-15]，并取得良好的治疗效果。匹多莫德为口服剂型，服药方便，患者顺应性好；病且患者费用较低，可以减少患者的经济负担。笔者尝试将其应用于重度烧伤患者，匹多莫德的主要成分为吡酮莫特，为一种全合成的胸腺二肽类结构的新型免疫刺激和生物反应调节剂，通过调节和刺激免疫细胞产生效应，在人类和动物均有免疫刺激活性的发生[16]。匹多莫德在免疫反应的各个阶段均可起到作用，在快反应阶段可刺激非特异性自然免疫，促进γ-干扰素和IL-2的产生，使淋巴细胞母细胞诱导分化，在慢反应期可使体液免疫得到调节[17]，使B淋巴细胞增殖和抗体因刺激产生，通过这些免疫功能调节机制发挥作用，可降低和预防感染的发生。笔者研究发现，治疗组患者各测量点CD4+细胞的数量均较对照组多，7、14、30d明显增加，且差异有统计学意义，CD4+/CD8+比值也较对照组高。CD4+T细胞是辅T细胞，刺激B细胞成熟，分泌高效价的IgG，也能促进巨噬细胞及中性粒细胞的吞噬活性，提高其趋化性，并激活自然杀伤细胞，还能促进有丝分裂引起淋巴细胞增殖。CD8+T细胞为抑制性T细胞（Ts），CD4+/CD8+减低，提示机体使免疫功能低下，抗病能力下降。笔者临床观察中发现治疗组CD4+/CD8+均较对照组高，CD4+凋亡率明显低于对照组，提示匹多莫德对大面积烧伤患者有调节T细胞亚群，提高体液免疫和细胞免疫，改善免疫功能，加强免疫系统平稳机制，提高机体抗病的能力。是一种较好的免疫调节剂。
参考文献
[1]EdwardRS，ToliverK.Mechanismoftheinflammatoryresponse[J].BestPractResClinAuaestHesiol，2004，18（3）：385-405.
[2]刘慧琳，刘桂花，田兆兴.脓毒症患者血中淋巴细胞水平的变化[J].中华危重病急救医学杂志，2014，26（3）：148-152.
[3]冯祥生，张敬群，陈晓东，等.脱细胞异种真皮基质疗法对重度烧伤患者免疫功能的影响[J].中华损伤与修复杂志，2012，7（3）：36-40.
[4]MillerAC，RashidRM，ElaminEM.The“T”intrauma：thehelperT-cellresponseandtheroleofimmunomodulationintraumaandburnpatients[J].JTrauma，2007，63（6）：1407-1417.
[5]BantelH，Schulze-OsthoffK.Celldeathinsepsis：amatterofhow，when，andwhere[J].CritCare，2009，13（4）：173.
[6]MessarisE，MemosN，ChatzigianniE，etal.Time-dependentmitochondrial-mediatedprogrammedneuronalcelldeathprolongssurvivalinsepsis[J].CritCareMed，2004，32（8）：1764-1770.
[7]LeslieM.Immunology.Stallingsepsis？[J].Science，2012，337（6098）：1036.
[8]PeterME.Programmedcelldeath：Apoptosismeetsnecrosis[J].Nature，2011，471（7338）：310-312.
[9]WescheDE，Lomas-NeiraJL，PerlM，etal.Leukocyteapoptosisanditssignificanceinsepsisandshock[J].JLeukocBioc，2005，78（2）：325-337.
[10]刘扬，邓洁，齐云萍.淋巴细胞凋亡与老年心血管疾病[J].中国医学创新，2010，7（36）：190-192.
[11]巫治文，谢广渊.匹多莫德口服与雾化吸入对反复呼吸道感染疗效的比较[J].当代医学，2011，17（25）：20-21.
[12]黄建亚.匹多莫德治疗小儿反复呼吸道感染的临床效果观察[J].中外医学研究，2012，10（19）：12-13.
[13]申琴玉.匹多莫德治疗儿童反复呼吸道感染78例疗效观察[J].中外医学研究，2011，9（19）：37-38.
[14]马柱.匹多莫德对小儿反复呼吸道感染的治疗分析[J].中国医学创新，2010，7（19）：72-73.
[15]谢鹏，邹敏，黄洁.匹多莫德、小剂量糖皮质激素辅助治疗小儿支原体肺炎80例临床观察[J].中国医学创新，2014，11（10）：78-80.
[16]赵丽珍.匹多莫德口服液预防小儿支气管哮喘的临床分析[J].药物与临床，2011，49（16）：86-87.
3月收集的500份尿液标本为研究对象，对其分别行尿液干化学分析仪检验和传统手工法检验，对两种方法检查结果及阳性符合率进行比较。结果：尿液干化学分析仪尿蛋白、红细胞及白细胞检测阳性率分别为15.2%、24.0%、20.0%，传统手工法尿蛋白、红细胞及白细胞检测阳性率分别为16.0%、22.0%、20.4%，差异均无统计学意义（字2=0.1215、0.5647、0.0248，P>0.05）。两种方法中尿蛋白、红细胞及白细胞检测结果存在一定的差异，尿蛋白符合率为98.4%，红细胞相符率为97.1%，白细胞相符率为96.5%。结论：尿液干化学分析仪与传统手工法在尿常规检查中各有优势，均可作为初步筛查手段，两者联合利用效果更佳。
【关键词】尿常规检验；尿液干化学分析仪；传统手工法
中图分类号R446.12文献标识码B文章编号1674-6805（2016）3-0053-02
doi：10.14033/ki.cfmr.2016.3.028
尿常规作为“三大常规”检查之一，可初步显示患者身体各项指标，特别是肾脏疾病，可作为早期肾脏病变诊疗的主要标志之一[1]。目前临床上检查尿常规的方法很多，如传统手工法、尿沉渣镜检及尿液干化学分析仪等，各有优缺点。其中尿液干化学分析仪具有操作简单、灵敏度高、方便等特点，逐渐成为现代临床尿常规检查的主要手段[2]。本研究对笔者所在医院随机抽取的500份尿液标本分别进行尿液干化学分析仪与传统手工法检验，比较两种尿常规检验方法结果，现报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料
随机抽取笔者所在医院2012年3月-2013年3月收集的500份尿液标本为研究对象，均于早晨收集，用一次性消毒塑料杯保存。其中男345例，女155例，年龄7～82岁，平均（50.2±1.5）岁。
1.2检测方法
材料：离心机、显微镜、干化学尿液分析仪及试纸、冰醋酸、酒精灯。
本组500份尿液标本分别采取干化学分析仪和传统手工法检验。尿液干化学分析仪：于早晨采集尿液标本，严格按照干化学分析仪使用说明书及要求操作，主要测量尿液中尿蛋白、白细胞及红细胞指标含量，仔细记录检测结果。传统手工法：该方法主要检测指标与干化学分析仪一样，即尿蛋白、白细胞及红细胞，其中尿蛋白数据通过冰醋酸加热检测获取，红白细胞则通过尿液离心后显微镜检测，具体来说，经由尖底离心管（10ml）抽取10ml的尿液（已混合均匀）进行离心操作，设置离心参数为1500r/min，时间为5min。去除尿液上清液，遗留0.2ml左右沉渣，涂片（镜检片）后放到显微镜下检测，做好红白细胞检测结果记录。这里要注意的是，检测中尿液沉渣要在1h内被检测，避免错过最佳检测时机而影响检测结果。
1.3观察指标
对两种不同尿常规检验方法结果进行观察和记录，并进行比较，统计两种方法检验阳性符合情况。
1.4统计学处理
采用SPSS18.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P
2结果
2.1两种检查方法结果比较
尿液干化学分析仪尿蛋白、红细胞及白细胞检测阳性率分别为15.2%、24.0%、20.0%，传统手工法尿蛋白、红细胞及白细胞检测阳性率分别为16.0%、22.0%、20.4%，上述指标比较差异均无统计学意义（字2=0.1215、0.5647、0.0248，P>0.05），详见表1。
2.2两种不同检测阳性、阴性结果情况
两种方法中尿蛋白、红细胞及白细胞检测结果存在一定的差异，尿蛋白符合率为98.4%，红细胞相符率为97.1%，白细胞相符率为96.5%，具体见表2。
表2两种不同尿常规检测方法阳性、阴性结果相符情况
检验指标阴性（份）
阳性（份）
符合率（%）
符合不符合符合不符合
尿蛋白41818741898.4
红细胞370301082697.1
白细胞378351013296.5
3讨论
尿常规检查是临床诊疗的必要项目之一，它能客观、有效的反映出患者身体各项指标（尤其是肾脏病变）[3]。随着现代医疗技术及人们健康意识的不断提高，人们对临床检查敏感度及正确率提出更高的要求，同时提高血常规、尿常规等实验室指标检测水平也是现代医学努力的方向[4]。
目前临床上检查尿常规的新型手段为尿液干化学分析仪，具有检测对象（尿液）量需求少、快速、工作效果高等特点，能在短时间内为医生提供诊断依据，便于及时采取对症治疗[5-6]。但尿液干化学分析仪在临床检验过程中易受药物、环境、检测水平等诸多因素影响，在尿蛋白、白细胞检测上存在一定的缺陷，部分肌红蛋白、菌尿易呈现假阳性现象，维C呈现假阴性现象[7-8]。另外该检测方式要综合考虑镜检（特别是结石、结晶）等。传统的尿常规检查方法为手工镜操作，通过显微镜可以直观、真实的反映出尿液成分，特别是可以清晰的观察到红细胞数量及其在尿液中的存在形态，是当下其他尿常规检验方法所不能比拟的。但传统手工法的不足之处在于对尿液标本要求高，易受标本采集、保存、环境等影响，检测效率不是很理想，特别是健康人群疾病筛查中，难以准确地判断病理[9-10]。
本研究两种不同尿常规检验方法结果显示，相比传统手工法，尿液干化学分析仪红细胞阳性检出率更高，但差异无统计学意义（P>0.05）。另外两种方法红细胞、白细胞及尿蛋白检测结果存在不同程度的差异。由此可见传统手工法、尿液干化学分析仪各有优缺点，在临床上可有机结合起来，同时有效提高两种方法检测水平，提高阳性检出率及检测准确率，为临床诊疗提供依据，更好的为患者服务。
参考文献
[1]刘海燕，崔健.两种尿常规检验方法结果对比分析[J].医学信息，2013，26（2）：102-103.
[2]张冬梅.尿常规检验干化学法和手工法结果对比分析[J].当代医学，2010，16（2）：94-95.
[3]丁茗载，程莉，赵瑛.尿液干化学分析与尿沉渣镜检的关系探讨[J].临床军医杂志，2009，31（4）：122-123.
[4]黄学斌，陈华根，宋强，等.重视尿常规检验质量控制保证检验结果准确[J].医学理论与实践，2013，35（11）：97-98.
[5]LteifAA，HanK，MatherKJ.Obesity，insulinresistance，andthemetabolicsyndrome：determinantsofendothelialdysfunctioninwhitesandblacks[J].Circulation，2013，112（1）：32-38.
[6]HarredJF，KnightAR，McIntyreJS.Inventors.Dowchemicalcampany，assigneeexpoxidationprocess[J].USPatent，2012，3（17）：1904-1927.
[7]ZhangY，LiW，YanT，etal.Earlydetectionoflesionsofdorsalarteryoffootinpatientswithtype2diabetesmellitusbyhigh～frequencyultrasonography[J].JournalofHuazhongUniversityofScience&Technology，2011，29（3）：387-390.
[8]FoleyRN，ParfreyPS，SarnakMJ.Epidemiologyofcardiovasculardiseaseinchronicrenaldisease[J].JAmSocNephrol，2013，9（12Suppl）：S16-S23.
[9]MalyszkoJ.Mechanismofendothelialdysfunctioninchronickidneydisease[J].ClinChimActa，2010，411（19/20）：1412-1420.
[关键词]基础医学概论；免疫系统；教学设计
基础医学概论是一门供医学院校非医学专业学生学习，了解医学概貌，掌握必要的医学基础知识的重要整合课程。其内容以“分子一细胞一器官一系统”为主线，涵盖了系统解剖学、组织胚胎学、生理学、生物化学、病理学、病理生理学、免疫学、病原生物学、药理学、遗传学等十门课程[1]，通过对基础医学各学科内容进行整合、重组和优化，从而加深学生对基础医学知识系统性的理解和掌握。
机体的免疫系统是基础医学概论中非常重要的一章，涉及了系统解剖学、组织胚胎学和医学免疫学等学科，其教学内容深奥枯燥、概念抽象繁多、机理复杂，一直都是教学中的难点。下面笔者以此章为例谈一下在基础医学概论教学设计中的体会。
1教材分析
笔者所讲授的是普通高等教育“十一五”部级规划教材《基础医学概论》[2]第18章“机体的免疫系统”。目前的理论学时为10个学时，要完成教材整章的教学任务几乎是不可能的。因此，结合非医学专业学生的特点，选择免疫系统的组成和密切联系特异性免疫应答两条主线（细胞免疫应答与体液免疫应答）的相关理论知识进行讲授，对面面俱到的教材做一个大幅度的修剪，达到“够用”为度。如免疫耐受、超敏反应、免疫学诊断、预防和治疗等作自学内容。
2教学目标
根据之前所述教学内容，结合学生知识基础，确定如下教学目标。
2.1知识目标：①掌握免疫系统的组成及功能；②掌握免疫器官的组成；③掌握重要的免疫分子：免疫球蛋白的概念、结构和功能；补体系统的概念及功能；④掌握细胞免疫应答和体液免疫应答的基本过程；⑤熟悉T、B淋巴细胞的重要表面标记分子；⑥熟悉单克隆抗体的特点及应用。
由于学生在高中生物时接触过免疫系统，对其分类、组成及功能有一定的认识，对该部分知识的加深与拓展也较易理解，因此本章的难点在于细胞免疫应答和体液免疫应答的基本过程。
2.2能力目标：在知识目标完成的基础上，我们力争实现培养学生自主学习、分析、处理问题能力的能力目标。
2.3情感目标：通过讨论，激发学生的想象力，使创造性思维得到充分发挥；通过小组协作，培养学生团队合作学习意识和探索精神。
3教学方法
非医学专业招生大多是文理兼收的，有些学文科的学生只是死记硬背，对涉及较复杂机制的内容理解起来相对困难，极易形成思维疲劳，失去对该门课程的学习兴趣。为激发学生的课堂学习兴趣，充分调动学习积极性，提高教学质量，在教学过程中，我们采用各种教学方法：如讲授法、比喻法、讨论归纳法、案例分析法、PBL教学法等，提出问题找到基础与临床与生活经验的切入点，循序渐进将科学知识的讲授融入到教学过程中。如在讲解免疫系统的三大功能时，首先提出问题：20世纪80年代世界上发现了一种有“世纪瘟疫”之称的疾病——艾滋病，对艾滋病，同学们有多少认识？同学们知道艾滋病患者会有什么临床表现吗？引导学生自由发言。然后提出问题：为什么会出现这些症状？结合免疫系统的三大功能的形象比喻：把免疫防御功能比喻成国家的国防部队抵御外敌入侵，把免疫监视功能比喻成人民警察监视内部“突变”人群，把免疫自稳功能比喻成清洁工等，使学生能更好的形象理解，而且课堂气氛活跃，在师生讨论、互动中，轻松的掌握了知识点，达到了教学目的。
4教学过程设计
4.1多种方式，导入新课
常言道：好的开始是成功的一半。成功的新课导入能像磁铁一样牢牢地吸引学生的注意力，是激发学生求知欲望和参与意识以及开启创新思维的第一步[3]。新课导入的方法是多种多样的，如温故导入法、提问导入法、故事导入法、情境导入法、疑问导入法等。如讲“机体的免疫系统”这一章绪论时，首先通过口头提问：人体的“国防部队”是什么？一个国家需要有自己的军队来抵御外来的敌人、保卫国家的安全、维护人民生活的稳定，那么人体的“国防部队”有什么功能？以此来唤起学生对相关知识的记忆，导入新课。在巩固旧知识的基础上，又提出新问题：人体的这个“国防部队”是怎样运作的？这时学生带着寻求新知识的强烈欲望，进入了新学习情景中，既激发了学生“温故而知新”的求知欲，又在潜移默化中提高了学生的思维判断能力。在讲“补体系统”这一节时，我们可以这样设问置疑，“异型输血会出现什么后果？”，“溶血”；“而在血型检测试验中，A型血与A标准血清体外出现凝集现象，这说明什么问题？”，“人体内有溶解红细胞的物质——补体”；“为什么正常时不出现溶血？”，“为什么体外很容易失去活性?”等等。这样的设问使教学内容产生了巨大的诱惑力，大大地提高了教学效果。
4.2结合教具，运用多种教学方法进行授课
在“机体的免疫系统”的第一节授课中，笔者首先采用案例分析法引入免疫的概念，通过对一流行性腮腺炎病例进行分析，启发学生联系自身经历，从而提出抗原的概念、免疫的概念以及免疫特异性这一重要特点；采用比喻法将抽象内容具体化，形象的指出免疫系统的组成及功能；利用多媒体课件形象直观、图文并茂的特点，讲授中枢免疫器官的解剖学特点和组织学特点，通过启发式教学引出临床骨髓穿刺的部位；利用课堂讨论法，并结合多媒体视频展示骨髓和胸腺的功能。最后利用归纳式板书的方式对本次课内容进行回顾总结，帮助学生系统式掌握并记忆。
4.3问题小结，引发思考
⑴人类在许许多多病菌、病毒存在的环境中为什么能健康地生活？为什么老年人或应用免疫抑制剂的人肿瘤发病率较高？得过流行性腮腺炎的病人一般不再患流行性腮腺炎，为什么？
⑵无偿献血对人体有害吗？为什么？胸腺在机体免疫中起什么作用？
4.4课程总结
本次课的教学设计与教学探索实施过程中，实现了免疫系统在基础医学概论课程中的整合，实现了基础教学与专业能力培养的有效结合，加强了学生的团队协作能力和自主学习能力，并培养了其合作学习意识和探索精神。
基础医学概论作为一门整合课程，由于教学内容上的复杂性、特殊性，授课对象的特定性，使其在教学过程中容易出现一些问题。因此对于教学过程就提出了更高的要求，教师要注重教学内容的选择，教学方法的改进，通过科学的教学设计，提高教学效果。
参考文献:
[1]金昌洙,刘卫东.基础医学概论的教学实践与思考[J].中国高等医学教育,2011(4):76-77.
[2]李利兵,朱大年,汪华侨.基础医学概论[M].北京:高等教育出版社,2008.
[3]魏宏聚,李瑞.课堂导人环节与情感目标达成的分析[J].天津师范大学学报（基础教育版）,2011,12(4):29-33.
上一篇：护理科普工作总结(整理14篇)
热门推荐