细胞生物学研究技术(6篇)
时间：2024-09-24
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生物医学电子显微学是电镜技术与生物医学相结合的边缘学科，是应用电镜观察研究细胞亚显微结构及其变化，揭示细胞结构与功能的科学技术，对建立现代医学完整形态学知识结构体系及分子生物学的研究至关重要。为生物医学专业研究生开设《生物医学电子显微学》课程，旨在使学员系统地学习超微结构知识，掌握超微结构的研究方法和实用意义，扩大科研思路，为课题设计和研究打下良好的基础。我室在多年教学实践中，经过积极探索，对教学内容、教学方法进行了系统的改革，几年的教学实践证明，这一改革取得了明显的效果。
1构建面向适应能力培养的教学内容
《生物医学电子显微学》的教学对象主要是硕士研究生，其目的是使学员掌握与研究相关的超微结构研究的实验技能，为超微结构研究奠定实验技术基础，拓展课题研究思路。为了使课程具有足够的宽广度和纵深度，并具有前沿性和前瞻性，提高超微结构的研究水平，突出电子显微学在基础医学及临床研究中的应用［1］。首先，将细胞超微结构纳入电镜技术的教学，系统地充实有关新的电镜技术和细胞超微结构的理论知识，把超微结构理论知识与电镜技术整合为生物医学电子显微学，作为一门学科进行建设。通过两部分内容的有机结合，让学员在学习电镜技术时了解细胞超微结构，在学习细胞超微结构的过程中掌握电镜技术。另外注重融合、吸纳本学科前沿的研究成果和实验实例，更新教学内容，将细胞生物学、分子生物学中的新进展、新技术融入教学，增设了培养细胞电子显微学研究技术、特殊组织细胞（如海马）的取材技术、电镜原位杂交技术、硝酸镧示踪技术、钙离子示踪技术等，使课程内容紧密结合基础研究和临床应用，为研究生更好的利用电镜技术为基础医学和临床研究打下基础。为了使研究生更好地进行超微结构研究，我们建立了开放型技术平台［2］，为研究生课题研究提供选题设计、实验技术方法、镜下图像观察、结果分析与论文撰写等技术指导，既保证了研究生课题的顺利进行，也促进了本学科实验技术的发展，充实了教学内容。同时多层次与我校形态学专家建立良好的协作关系，聘请他们协助指导研究生超微结构研究工作。
2实施有利于实验技能培养的教学法
改革教学方法，突出对研究生创新能力、实践能力的培养，增进研究生的科学素质;改进训练方法，解决课程中的重点与难点教学，加强实际工作能力的训练;应用多种辅助教学手段，建立互动教学园地，提高了教学质量。
2.1理论教学
在细胞超微结构的教学中采用大量典型的各系统超微结构照片、模式图和事例充实理论教学内容，使学员了解细胞亚显微结构的异常改变与功能变化、发病机理及疾病的关系，从而认识到电子显微学在疾病病因、病情、分型及鉴别诊断中的重要性。在有关电镜的结构与原理的教学中应用多媒体、视频、动画和实物等多种辅助教学方式，将抽象的理论形象化。在讲解样品制备技术时，强调取材的重要性，通过介绍失败事例使学员认识到样品制备在超微结构研究中的重要性。
2.2实验教学
在实验教学中重点训练学员基本技能，培养动手能力，使其掌握正确规范的实验技能。通过实验教学加强学员对课程的重点、难点的理解和掌握:①突出重点，培养学员的动手能力;②突破难点，使学员掌握电镜操作技能;③强调镜下观察分析的重要性，提高学员的研究能力;④考试、考核并举，重在能力培养。
3新教学法的实施效果
通过教学体系的改革与调整，拓展了教育规模，提高了学员对生物医学电子显微学的认识及科研技能掌握和应用的能力，增加了选课率，增加了研究生在课题研究中的电镜使用率。两年来完成了593人次.2374例的样品测试任务。通过对教学内容、教学方法的改革，以及新技术、新方法在教学中的应用和充实，促进了教员查阅文献的主动性，追踪技术进展的积极性，使教员队伍综合素质整体跃升。通过建立开放型技术平台，促进了电镜实验技术的发展，两年来协助完成科研任务474项，在临床医生和研究生的配合下开展了电镜诊断研究，涉及到肿瘤疑难病例的诊断、肾穿刺活检的电镜诊断、神经.肌肉活检电镜诊断等，开展了对细胞组织起源的鉴定，细胞损伤的早期观察，纳米材料的测定等，既提高了自身的业务水平，又解决了临床疑难，推动了临床科研，提高了电镜的有效使用率，使教学改革成果显著。
［参考文献］
诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPS）是通过基因转染技术(genetransfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）细胞样的多潜能细胞。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。iPS细胞的研究受到人们广泛的关注，是目前细胞生物学和分子生物学领域的研究热点。iPS细胞技术诞生还不到2年，却为干细胞的基础研究和临床疾病治疗研究带来了前所未有的希望，iPS细胞技术的出现使人们从ES细胞和治疗性克隆等激烈的伦理学争论中解脱出来。但是，目前制备iPS细胞的方法在安全性方面还存在一定问题，因此探索一种高效、安全的iPS细胞的制备方法显得十分必要。
1iPS细胞的制备方法
2006年Takahashi等［1］研究小组利用分别携带Oct4、Sox2、Myc和Klf4转录因子的4种逆转录病毒载体感染小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblasts，MEFs)，经过G418药物筛选成功获得第1批iPS细胞。但是这批iPS细胞系中DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞不同，而且这批iPS细胞不能形成畸胎瘤。Okita等［2］研究小组报道了第2批iPS细胞的产生。他们采用与制备首批iPS细胞相同的方法，但是采用了不同的筛选基因。第2批iPS细胞系DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞的甲基化方式相同，并且能形成畸胎瘤。2007年末，Takahashi和Yu等［3，4］两研究小组分别在细胞和科学杂志上报道关于iPS研究里程碑的实验结果，他们都成功获得了人的iPS细胞系。Yamanaka采用与诱导小鼠iPS相同的方法，成功将人成纤维细胞诱导成多干细胞。Thomson研究小组采用与Yamanaka不同的方法，他们利用慢病毒载体运输Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子转染IMR90胚胎成纤维细胞，并且成功地获得了人iPS细胞。2008年1月Nakagawa等［5］研究小组报道他们可以利用Oct4、Sox2和Klf43种转录因子将小鼠和人的成纤维细胞成功诱导出iPS细胞。Aoi等［6］研究小组将小鼠肝细胞和胃上皮细胞成功诱导为iPS。Stadtfeld等［7］实验小组利用Oct4、Sox2、cmyc和Klf44种转录因子将胰岛细胞诱导为iPS细胞。
Hanna等［8］研究小组在细胞杂志上报道了他们将小鼠终末分化的B淋巴细胞诱导成iPS细胞的实验结果。他们采用类似于利用成纤维细胞制备iPS细胞的方法，使用4种转录因子（Oct4、Sox2、cMyc和Klf4）及CCATT/增强子结合蛋白（C/EBPα），成功地将成熟B淋巴细胞诱导为iPS细胞。
Eminli等［9］研究小组利用逆转录病毒载体携带Oct4、Klf4和cMyc3个转录因子将神经祖细胞诱导为iPS细胞，之后Kim等［10］研究小组报道利用慢病毒载体携带Oct4和cMyc或Oct4与Klf4两种转录因子就可以将成人的神经干细胞诱导为iPS细胞。他们检测到在成人神经干细胞中Oct4和cMyc的表达量高于胚胎干细胞中Oct4和cMyc的表达量，因此考虑利用逆转录病毒载体只携带两种转录因子诱导成人神经干细胞为iPS细胞并获得成功。由此他们推测当被诱导的体细胞中高表达某个或某几个转录因子时，可以减少其他转录因子的使用。
当一系列人正常体细胞被诱导成iPS细胞之后，科学研究者开始研究患者的细胞是否也能诱导成iPS细胞。Dimos等［11］研究小组报道他们将肌萎缩侧索硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）患者的细胞成功诱导成为iPS细胞。随后Park等［12］报道他们将腺苷脱氨酶缺陷相关严重的联合免疫缺陷、三型葡萄糖脑苷脂沉积症、帕金森综合征、舞蹈症、青少年I型糖尿病等患者的细胞诱导为iPS细胞。
体细胞可以诱导为iPS细胞，但是获得iPS细胞的几率很低。于是科学研究者们研究能否找到提高iPS细胞产生效率的方法。Mali等［13］报道他们将SV40大T抗原和Oct4、Sox2、cMyc和Klf4同时诱导成纤维细胞能显著提高iPS细胞产生的效率，而且iPS细胞提前1～2周产生。Huangfu等［14］报道DNA甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂能显著提高iPS细胞产生的效率。Aasen等［15］研究小组报道采用逆转录病毒运输Oct4、Sox、Klf4和cmyc诱导人角化细胞产生iPS细胞的效率比诱导人成纤维细胞产生iPS细胞的效率至少提高100倍，而且大大缩短了产生iPS细胞的时间。
Maherali等［16］研究小组报道了制备iPS细胞新的研究平台，并指出可从分子、遗传和生化机制上改造细胞程序重排技术。他们开发了一种新的iPS细胞诱导技术，采用doxycycline诱导转录因子的表达，从而可以通过药物来控制iPS细胞的产生，其制备的iPS细胞从结构和功能上都与人类胚胎干细胞很相似。人们研究发现，不同的皮肤细胞类型用于诱导产生iPS细胞的时间也不同［16］。Huangfu等［17］研究小组报道仅利用反转录病毒表达Oct4和Sox2两种转录因子，同时借助抑制组蛋白去乙酰基酶活性的小分子化合物丙戊酸（ValproicAcid，VPA）的作用就能将人的成纤维细胞系BJ和NHDF逆转成iPS细胞。
最近，Stadtfeld等［18］报道他们利用腺病毒载体运输Oct4、Sox2、Klf4和cMyc4种转录因子成功获得无病毒整合的iPS(AdenoiPS)细胞。Okita等［19］研究小组采用2种质粒分别携带Oct4、Sox2和Klf43种转录因子和cmyc转录因子共转染人或小鼠的体细胞并使之诱导成为iPS细胞，经过检测并无质粒整合进入iPS细胞基因组中，即获得了在基因组水平无转录因子整合的iPS细胞。Frank等采用带有loxpCre系统的病毒载体诱导iPS，此系统可将整合到iPS基因组中的4种外源转录因子及病毒基因成分完全剔除，因而所获得了完全没有病毒基因组的来源于Parkinson患者成纤维细胞的iPS;而Knut等人使用含有转座子系统的病毒载体也成功获得了完全没有病毒基因组的来源于人胚胎成纤维细胞的iPS。这些无病毒基因组成分的iPS诱导成功为其临床实际应用奠定了基础。iPS细胞产生的方法归纳见表1。表1诱导iPS产生的方法
小鼠胚胎成纤维细胞［13］Oct4，Sox2，Klf4小鼠及人成纤维细胞［5］Oct4，Klf4，cmyc神经祖细胞［9］Oct4，Klf4成人神经干细胞［10］Oct4，cmyc成人神经干细胞［10］Oct4，Sox2，cmyc，Klf4，Nanog人角质细胞［16］Oct4，Sox2人成纤维细胞系BJandNHDF［17］
2iPS细胞的应用
iPS细胞技术是一把了解细胞核基因组重序(reprogramming)的钥匙，因为iPS细胞在功能上与胚胎干细胞几乎完全相同。因此，iPS细胞的诱导产生过程将是我们了解基因组重序分子机制和个体特异的疾病发生机制的最理想的模型。Hanna等［20］近期已经进行了iPS细胞应用基础研究的首次尝试，利用人类镰状细胞性贫血的小鼠动物模型，取其尾尖部皮肤的成纤维细胞，通过导入Oct4、Sox2、Klf4和cMyc基因，获得自体iPS细胞;进一步采用基因特异性打靶技术对人类镰状血红蛋白等位基因进行纠正后，将体外培养的自体iPS细胞诱导为造血干细胞，移植后可治疗动物模型的镰状细胞性贫血。Dimos等［11］报道将ALS患者的体细胞诱导获得的iPS细胞成功定向分化为运动神经元，而ALS疾病的特征就是患者的运动神经元受到破坏。与此同时，Martin研究小组发表将Oct4、Sox2、Klf4和cMyc诱导得到的iPS细胞定向分化为有功能的心肌细胞的研究结果。
3iPS的安全性
iPS细胞技术的问世为生命科学的研究和人类疾病的治疗带来巨大的希望，随着研究的深入进行，多种终末分化细胞甚至是患者的细胞都能被诱导成iPS细胞，还有iPS细胞初步应用小鼠疾病模型治疗的成功，这一切似乎预示着iPS细胞距人类疾病的临床治疗不远了。但是，iPS在投入临床疾病治疗之前，必须考虑iPS细胞安全性的问题。目前制备iPS细胞的方法主要是利用逆转录病毒运输系统将几种转录因子导入体细胞，逆转录病毒在染色体上随机插入整合到体细胞基因组内并启动转录因子的表达。逆转录病毒的随机插入存在着潜在的风险，有的转录因子如cmyc和Klf4，它们本身就是一种原癌基因，导入cMyc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20%［2］。由于cMyc基因具有危险性，研究者投入无cMyc基因的iPS研究，但是经过研究发现这些无cMyc基因的iPS细胞依然具有致瘤性。
4展望
iPS细胞技术诞生还不到2年，但却受到极大的关注和广泛的研究，现已成为生命科学研究领域研究和探讨的焦点，为基础研究和临床疾病治疗带来前所未有的希望。人类iPS细胞的建立被公认为2007年最重要的科技进展之一，这项技术不仅可以从体细胞建立个体特异的多能干细胞系，解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题，而且为研究人类细胞的重编程的机理以及研究个体特异的疾病发生机理提供了有力的方法。在干细胞研究领域，iPS细胞技术的出现无疑是具有里程碑意义的突破，多种体细胞经过体外培养和诱导均可转变成为具有多向分化潜能的干细胞，并且证明了几种已知的转录因子可以使已分化的体细胞逆转为未分化的状态，表明细胞的巨大可塑性。但是，iPS细胞在应用于临床之前，还面临许多问题:①逆转录病毒和慢病毒载体导致肿瘤发生的潜在风险需要加以有效防范;②需要深入研究比较iPS细胞和hES细胞在细胞生物学特性、定向分化机制等方面是否具有显著的差异;③需建立一种新的方法以避免基因转染或基因转导带来的潜在风险，如通过某些化学药物或因子激活体细胞中固有的上述转录因子的方式以替换外源性基因转染的方式，或者用某些因子的短暂性表达代替永久性导入;④提高制备iPS细胞的效率。需指出的是，iPS细胞研究的突破并不意味着ES细胞研究的衰亡，因为iPS细胞所使用的转录因子正是来源于ES细胞长期研究的积累。
参考文献
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［8］HannaJ，MarkoulakiS，SchorderetP，etal.DirectreprogrammingofterminallydifferentiatedmatureBlymphocytestopluripotency［J］.Cell，2008，133(2):250-264.
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［17］HuangfuD，OsafuneK，MaehrR，etal.InductionofpluripotentstemcellsfromprimaryhumanfibroblastswithonlyOct4andSox2［J］.NatBiotechnol，2008，26(11):1269-1275.
器官和组织的缺损或衰竭是临床遇到的极具危害性的医学难题，尽管目前人们通过器官或组织移植、外科再造和使用机械装置等治疗手段，解决了一些现实问题，但这些方法均存在不少缺陷。因此，人们一直在寻求一种新的治疗方法。随着多学科成果和技术不断交叉、融合和相互渗透，逐渐形成了一门新的交叉学科——医学组织工程学。作为一场意义深远的医学革命，在医学界它被誉为是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上又一新的里程碑。
1医学组织工程概述
组织工程学概念的提出始于20世纪80年代末，由于其重要的科学意义、巨大的临床应用前景、潜在的开发价值，受到了各国科学界的重视。医学组织工程学利用工程学和生命科学的原理来研究和发展具有生物活性的人工替代物，融合了细胞生物学、工程科学、材料科学和临床医学等相关知识。核心理念就是将体外培养的高浓度的正常细胞扩增后，吸附在生物材料上，形成具有三维空间结构的复合体，然后将复合体植入组织器官的病损部位，种植的细胞在生物材料被机体逐渐降解吸收过程中继续生长繁殖，形成新的具有相应形态和功能的组织和器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的［1］。其最大优点是可形成具有生命力的活体组织，进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代，根据组织器官缺损情况进行塑形，达到完美的修复。
目前组织工程学的研究手段已经不再局限于初始阶段的细胞生物学和动物实验技术、分子生物学技术，而是广泛应用基因克隆技术、转基因技术、移植免疫学技术、生物材料合成与改良技术、生物材料的编织技术、生物力学技术、影像学技术和生物反应器等先进技术［2］，极大地提升了组织工程学的研究水平和其自身的发展速度。与传统的自体或异体组织、器官移植相比，克服了以创伤修复创伤的缺陷，将从根本上解决组织、器官缺损的修复和功能重建等问题。
2种子细胞
种子细胞是医学组织工程的生命源泉，它要确保在体外培养时有很强的增殖能力，并能定向分化，同时要保持其原来的生理性状。大多数观点认为种子细胞进入新的微环境后，会对新的微环境中的调节信号做出反应，从而定向分化为目的细胞。同时具备这些特点的干细胞就成了种子细胞的首选。应用干细胞治疗疾病较传统方法还具有低毒性，一次药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；避免产生免疫排斥反应等诸多优点。在临床治疗中，造血干细胞应用较早，在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规治疗，且效果令人满意。
按分化潜能干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能性干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（简称ES细胞），它可从早期胚胎的原始胚细胞及原始生殖细胞中分离培养获得，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，能分化出成体动物的所有组织和器官。由于在医学和生物学上具有巨大的潜力，而备受各国的高度重视，使其成为当前生物工程领域的核心问题之一，在这一领域，世界性的研究开发竞争正在迅速展开。ES细胞最诱人的前景是生产组织和细胞，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供源源不尽的无免疫性的材料。任何涉及丧失正常细胞的疾病都可以通过移植细胞来治疗，包括帕金森病、糖尿病、外伤性脊髓损伤、细胞变性病、心肌病和骨损伤等［3］。尽管ES细胞培养体系和来源问题研究已经取得了巨大进展，但应用于临床还存在很多技术上的难题：其中最为重要的是其分化问题，目前关于ES细胞自我更新机制及其向不同组织细胞分化的机制均尚不清楚，因此如何防止其在体外培养时发生分化以及如何诱导得到纯化的分化细胞尚待研究；由于人胚胎干细胞来自具有发育成一个个体潜力的人胚胎，所以其研究不可避免地引发伦理道德问题的争议，并且在实际应用中还不能避免免疫排斥。
另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，一般认为其具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。人们可望从自体中分离出成体干细胞，在体外定向诱导分化为靶组织细胞并保持增殖能力，将这些细胞回输入体内，从而达到长期治疗的目的。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成体干细胞是普遍存在的，常位于特定的微环境中，问题关键在于如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞具有多分化潜能，其中骨髓基质细胞和脂肪源干细胞已有大量研究及部分临床应用，在个体化治疗中已用于骨、软骨、心肌再生等领域；在群体化治疗中需要解决同种异体移植的免疫原性问题，采用基因敲除技术或RNA清除技术去除抗原可能解决异基因细胞同种移植的免疫反应，但也有可能影响被敲除基因的其他功能［4］。最近，美国和日本相继公布了从人皮肤成纤维细胞转化为胚胎干细胞样细胞的研究成果，为解决这些问题带来了曙光，但要实现应用这一目标，还要进行更多、更深入的研究。
还有一类干细胞为单能干细胞，这类干细胞只能向一种类型或与之密切相关的两种类型的细胞分化。其中以脂肪源、肌源、上皮源及神经源干细胞为代表，作为组织工程的种子细胞，或以细胞治疗的方式进行了广泛研究，并已有临床应用的报道。
3支架材料
支架材料在医学组织工程研究中起中心作用，可为细胞提供黏附、增殖、分化并进而为组织的形成提供载体，还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。作为理想的生物支架材料至少应具备以下特点:①良好的生物相容性：植入机体内不会引起炎性反应和毒性反应损害新组织的功能，维持正常细胞功能发挥;②良好的可塑性：根据目的组织器官加工成特定的三维结构;③具有缓释功能：支架的降解速率可根据不同细胞组织再生速度进行调整，而且能彻底被新生的自然组织所替代;④支架的表面化学特性和表面微结构适合细胞粘附。因此寻找一种既具有良好生物相容性和生物降解性又具有特定形状和连通三维多孔结构的支架材料是组织工程成败之关键因素。
近年来，人们不仅在组织工程的最早产品人工皮肤领域进行了更为完善的研究和开发，同时，在诸如人工骨、软骨、神经、血管材料等各系统，都进行了大量的研究和探索。目前研究的组织工程支架材料各自有各自的优点但也有不可避免的缺陷。国外研究较多的是PGA、PLA、PL2GA等。这些材料具有可标准化生产、可降解、细胞相容性好等优点，但是这类材料本身亦存在一些固有不足，如生物相容性差及机械强度不稳定等。基于这些原因，研究人员一方面探索对聚醋类材料进行表面修饰，同时也在积极寻找其它类型的支架材料。通过对材料表面进行修饰，改善细胞与支架材料的相互作用;通过模拟细胞生长微环境，制备仿生材料，提高材料的亲水性、对细胞的黏附性，促进细胞的分化增殖。将合成材料与天然材料有机结合，已成为未来组织工程材料发展的新趋势。
研制复合材料、仿生材料、改性天然材料、纳米材料，是当前支架材料研究的主要方向。越来越多的学者设计出具有合适降解度、良好通透性、组织相容性好的软骨细胞体外培养支架材料。新材料的开发要求具有良好的各项生物学特性。通过将缓慢释放的生长因子或相关的基因整合到材料中，形成具有生物活性的生物材料，可以使种子细胞能在更接近于体内环境的生物材料上增殖、分泌基质、最终形成组织。
在组织工程材料的合成与制备中通过采用纳米技术对生物材料表面的改性或者直接采用纳米材料或复合材料，不仅能提高细胞对材料的黏附能力，也能提高材料的生物相容性，同时通过材料表面与细胞间相互的生物作用，能刺激并诱发所期望的细胞效应，有利于细胞的分化和增殖，纳米材料以其与传统材料无可比拟的生物学性能，已在组织工程和生物材料研究中显示出广阔的应用前景。纳米技术、组织工程技术和生物技术的发展与综合，将为培养支架的研究提供新的选择。
4生物活性因子
人体内的生长因子是通过细胞信号传递影响细胞活力的一类多肽因子，通过自分泌、旁分泌及内分泌作用，促进或抑制细胞生长、繁殖、迁移、黏附和基因表达的作用。在医学组织工程研究中，也需要在损伤组织的修复与病损器官的再生与功能重建中供给生长因子以促进种子细胞的分化和增殖。目前实验中常用的生长因子有成纤维细胞生长因子（FGF)、转化生长因子（TGF-β)、胰岛素样生长因子（IGF)、血小板衍化生长因子（PDGF)、骨形态发生蛋白(BMP)等等。它们不仅可单独作用，相互之间也存在着密切关系，实验证明复合使用效果更好［5］。
在医学组织工程领域，生物活性因子对外源性生长因子或类生长因子作用的药物大多采用缓释技术，使其促再生作用持续一段时间。已有很多缓释材料在研究中，但目前尚未解决缓释体的有效释药浓度与组织器官再生所需药物浓度的相适应性。生物活性因子应用的另一个问题是多因子的协同作用及有序作用仍不清楚。
5组织构建
医学组织工程的最终目的是构建组织器官修复体内缺损。构建组织工程化人体组织或器官，涉及种子细胞在生物反应器中大规模培养、扩增技术，生物力学信号施加和化学信使生长因子或细胞因子的控制释放技术等多项关键技术。现在部分组织工程化组织已在临床应用中取得了初步的疗效，充分体现了它在未来医学应用中的巨大潜力。最早经批准用于治疗和投入市场的移植物之一是组织工程皮肤植片。目前各国科学家们正在为多种组织，包括骨骼、肝脏、动脉、神经、胰脏、皮肤、肾脏和膀胱，构建组织工程结构［6］。但是体内环境是一个复杂的综合体，除了各种生长因子、细胞间相互作用以及局部酸碱平衡等因素以外，局部生物力学刺激也是一个重要因素。构建理想的组织还有很长的路要走。
就现在而言，医学组织工程领域所遭遇的最大的挑战之一是需要为复合组织和器官构建一个功能血管网。因为不论对于哪种组织和器官，血管形成都是关键性的；另外，单一的器官中含有多种不同的细胞，同时分离和扩增几种不同的细胞，目前在技术上有一定的难度；其次，在构建过程中维持严格的三维结构也是现有技术手段无法解决的难题。
6展望前景
人体是一个具有复杂的形态结构、完善的功能的整体，要完全模拟人体的组织和器官并非易事。虽然经过近20年的研究，医学组织工程已取得非凡的进展，应用组织工程的原理与方法，已能构建多种组织并成功的修复相应的组织缺损，诸如皮肤、骨和软骨等组织和器官更是成绩斐然［7］。但是还有许多理论和技术问题有待进一步解决：在种子细胞的培养方面，细胞的筛选和纯化是一个公认难题；在组织再生过程中发挥特异调节细胞增殖和分化作用的生长因子，可控性缓慢释放技术依然不完善；组织工程化组织在体外或体内形成过程中的演变规律如何？这些演变规律与正常组织发育、再生及创伤修复等过程有何异同，对这些问题目前仍然缺乏全面系统的了解。
医学组织工程的产业化无疑能够创造极大社会效益和经济效益，我国的组织工程研究从无到有逐步发展壮大起来，并取得了重要的研究成果。目前在研究开发上已经逐渐从临床前研究进人到临床试验阶段，如果我们能够创造出具有我国自主知识产权的组织工程产品，率先应用于临床，这样不仅可挽救众多病人的生命和肢体，促进相关学科的科技进步，更能造福于人类，为形成新的知识经济产业打下基础。参考文献
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【关键词】肿瘤;病理诊断技术;研究进展
细胞病理学创建至今已达150年左右，在此期间，生命科学取得了日新月异的发展，尤其是在近20年，现代生物化学、免疫学及分值生物学等学科得到突飞猛进的发展。电子显微镜的发明使得传统病理学诊断技术从细胞水平向亚细胞结构深入，免疫学知识与病理学不断融合，产生了免疫组织化学技术。另外，计算机技术在组织细胞图像处理中的运用，产生了定量细胞病理学。现代病理学采集了众多学科知识与技术，对肿瘤病理诊断具有重要意义。肿瘤病例诊断的准确性对医师制定治疗方案具有重要影响，同时也在一定程度上影响了医师对患者预后的判断，肿瘤病理诊断技术在临床中发挥的作用越来越重要。
1.肿瘤病理诊断技术分类
1.1电镜技术
电镜技术已经广泛应用于肿瘤的诊断中，且掌握了大多数肿瘤的超微结构及诊断要点。张宏波[1]在研究中指出，在电镜下可区分光镜较难区分的肉瘤及癌、腺癌及低分化鳞癌、各种恶性梭形肿瘤、神经内分泌肿瘤等，另外，一些未分化或分化较低的肿瘤在电镜下也无法确诊，需配合免疫组化等方法弥补电镜诊断的不足。
1.2免疫组织化学技术
近年来，免疫组化技术的快速发展使肿瘤病理诊断发生了巨大的变化，染色方法由ABC、PAP等发展为敏感性更高的免疫金银法[2]。李金明[3]认为针对不同类型的肉瘤和癌、中枢和外周神经肿瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤等特异性较高的单克隆抗体，免疫组织化学技术在极大程度上提高了肿瘤病例诊断的准确性。目前，临床肿瘤诊断通常采用细胞骨架中的中丝蛋白检测，包括上皮性肿瘤的细胞角质蛋白等。李小康[4]认为，随着大量病例的积累，以往临床上认为对某些肿瘤或组织具有特异性的标记物，包括上文所说的中丝，特异性也不明显，原因在于无论从哪种胚叶来源的肿瘤，因基因表达的变异，均存在多分化的潜能，也可出现上皮细胞向间叶细胞化生，或间叶细胞向上皮细胞化生等不同细胞间相互转化的现象，起源于同一胚叶的不同细胞可进行相互转化，因此，有可能出现不同类型的中丝同时表达的现象，使得诊断的难度加大。临床上已经了解多种原因可造成免疫组化染色的假阳性或假阴性。霍兰茹[5]等人为，对免疫组化不可过度迷信，对染色结果的判断需持更慎重的态度，并强调充分结合光镜常规染色切片观察的重要性。以往临床认为免疫组化技术可取代电镜技术，现对免疫组化技术持中肯态度，认为其需与电镜技术互相补充。
1.3细胞增殖活性测定
细胞增殖周期的概念对肿瘤学理论及实际工作具有重要意义，从肿瘤病理研究来看，对肿瘤细胞增殖活性的研究与肿瘤良恶性的甄别、复发和转移能力及预后等有着密切关系。目前用于测定细胞增殖活性的方法有很多，如S期3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺入技术、核分裂计数等。流式细胞术主要用于肿瘤细胞DNA含量的测定，以确定肿瘤的倍体术及细胞增殖活性。李新忠[6]认为，绝大部分良性肿瘤为二倍体，极少部分为非整倍体，恶性肿瘤多为非整倍体，高恶性肿瘤与低恶性肿瘤相比，非整倍体更为常见，由此可见，细胞增殖活性与恶性肿瘤的组织学分级相关，并可用该方法判断预后。核分裂计数是目前为止临床上最简而易行的判断肿瘤增殖活性的方法，对许多肿瘤的良恶区别及病理诊断具有重要意义，同时于组织学分级及预后联系密切。宋艳华[7]等认为核分裂计数可有效区分平滑肌瘤及平滑肌肉瘤，因此需对核分裂计数进行统一标准，可采用体视学原理进行核分裂计数。
1.4激素受体检测
肿瘤病例中，采用最多的是孕激素受体及雌激素受体的检测，可确定乳腺癌的预后及治疗方法的选择。以往临床上孕激素受体及雌激素受体的检测方法多以生化或组化方法，自从雌激素及孕激素受体单克隆抗体生产后，可采用免疫组化的方法确定孕激素及雌激素受体。韦敬[8]等人为乳腺癌分化越差，合成孕激素及雌激素的能力则越弱，孕激素与雌激素受体阳性率则越低，预后就越差。孕激素及雌激素阳性率高的乳腺癌可加用内分泌治疗从而获得良好的治疗效果。同时检测乳腺癌KI-67阳性率及雌激素阳性率可判断乳腺癌预后及选择治疗方案，采用KI-67测得癌细胞增殖较高，说明分化低、恶性程度较高，因此雌激素阳性率较低。以往临床上采用的抗雌激素抗体为H222，现发现新的抗体ID5，可稀释后使用，减少了检测的费用，且不受固定时间的影响，敏感性较高，值得临床推广。
1.5图像分析技术
临床上长期以来病例观察多以半定量或定性描述为主，使得肿瘤病理诊断、分型及分级等发生困难，也较难进行大系列的统计分析研究。图像分析技术在形态学领域的应用产生了形态测量学，为解决肿瘤病理诊断、分型及分级等困难带来了福音。在肿瘤病理学中，平面测量学技术是使用最为广泛的技术，也被称为图像细胞测量术[9]（ImageCytometry，ICM）。张亚娟[10]等在研究中提出，图像细胞测量术主要用于形态参数的测量分析、细胞核DNA倍体状态的图像分析及显色反应产物的图像分析。肿瘤细胞具有组织结构及细胞异型性，用ICM对细胞的核周长、核面积及核直径等进行测定，可更加客观的区分癌及癌前改变、肿瘤的病理组织学分级及良恶性肿瘤等。流式细胞术可对细胞核DNA进行测量，但是其无法进行形态学分析，可能忽略DNA异常的小细胞，加上混入样本的非肿瘤细胞干扰的结果，对某些实际上已有DNA倍体异常的病例得出假阴性的诊断。孙雪英[11]认为，ICM可依据细胞形态对异常细胞进行选择性测定，从而弥补了流式细胞术的缺陷，用ICM对DNA倍体状态进行测定可得出更加精确的组织学分级。ICM还可用于细胞化学、免疫细胞化学的显色反应产物定量分析。朱通伟[12]等认为，ICM可对细胞增殖活性、凝集素受体及癌基因产物等进行定量分析对肿瘤病理研究及实际应用具有重要价值。
1.6分子生物学技术
近年来，分子生物学技术在肿瘤病理研究领域引起了一场革命。有研究中认为，在核酸分子杂交技术、DNA重组技术等基础上发展的多聚酶链反应-单链构型多态性分析技术[13]等在肿瘤病理诊断中的应用给肿瘤病因学及发病学、基因诊断及治疗等方面的研究带来了巨大的发展。赵丽霞[14]等认为，分子生物技术对肿瘤有无基因突变的检测及判断预后具有重要意义，P53基因突变与乳腺癌、肺癌、结直肠癌等预后关系密切;K-ras基因突变与结肠癌及非小细胞性肺癌的恶性程度及预后密切相关。在肿瘤发病学及病因学方面，目前发现EB病毒与鼻咽癌、鼻腔T细胞瘤等有关，人体免疫缺陷病毒感染可引起淋巴瘤;人类状瘤病毒与食道癌及宫颈癌息息相关，另外，HBV与肝癌的关系正在研究中。
2.小结
总之，近年来，多种跨学科新技术的开展师德肿瘤病理学尤其是诊断性肿瘤病理学有了长足的进步。这不但使病理诊断更加准确，同时可更加客观的对肿瘤组织学分析、恶性程度及预测与后等进行判断，为临床治疗方案的选择提供了更加可靠的依据。另外，也对深入研究肿瘤发病学及病因学创造了更好的条件，对肿瘤的防治起到了积极的作用。各项新技术各有优势及不足，需相互补充达到相得益彰的结果。
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近4年来，娄晋宁领导的团队已经实施了26例胰岛移植治疗糖尿病研究。
他的团队从事的干细胞治疗糖尿病的研究可以说是当今医学界最前沿、最热门、最受瞩目的研究领域之一。由于理论体系的不完善，技术手段的局限性等诸多未解难题以及伦理道德方面的争议，使得干细胞的研究一直处于既让人无限期待，又被人不断质疑的纠结之中。
谁都知道创新之路的漫长和曲折，探索就会有失败，失败就会有收获。只有怀着内心梦想的人才可能持之以恒，锲而不舍。
做应用研究比做理论研究更难
娄晋宁的手机更像是一本常年随身的病历夹，往来的许多短信包含大量临床患者反馈的信息资料。
一个多月前，他们刚刚进行了国际首例人胚胎胰腺干细胞分化胰岛移植治疗1型糖尿病的临床研究。作为这个项目的主要负责人，娄晋宁需要及时了解每例患者的血糖、胰岛素用量以及患者其他指标的变化情况，以便在以后的研究中不断改进技术方法。
干细胞是体内存在的一类具有自我更新的能力，又有分化成为其他组织细胞潜能的特殊细胞可以用来制备各种功能细胞并应用于疾病的治疗。干细胞的研究也因此在全世界范围内如火如荼。
目前，有两类疾病应用干细胞治疗可能有效，一是神经损伤，二是糖尿病。因为，干细胞可以分化成为神经细胞和胰岛细胞，并且神经细胞和胰岛细胞移植证实能够有效治疗这些疾病。由此，干细胞研究被认为最有可能在这两个领域取得突破。
1978年进入大学学习前，娄晋宁已经有7年的临床医疗工作经验，经过5年医学院本科和3年中国医学科学院的研究生学习，奠定了他基础医学和临床医学的工作基础。在瑞士留学的10年间，娄晋宁先后从事了脑型疟疾，多发性硬化，移植免疫排斥、缺血-再灌注损伤和胰岛移植治疗糖尿病等方面的研究。由于具有基础研究和临床医疗两方面的工作经验，娄晋宁更热衷于将基础研究的结果与临床应用相结合。但他也深知“做基础研究的人不容易，要把基础研究转化成临床应用更不容易”。
娄晋宁和他的团队一直承担国家“十一五”计划和“十二五”计划干细胞技术治疗糖尿病的研究课题。研究主要采用人胚胎胰腺组织来源的干细胞，通过体外扩增和定向诱导分化制备成胰岛内分泌细胞，并将这些细胞诱导成为胰岛样结构。
在体外证实这些分化的胰岛能够对葡萄糖刺激产生胰岛素释放后，它们先后在糖尿病小鼠模型和糖尿病大鼠模型都获得了满意的治疗效果。之后，他们进一步应用胰腺全切除手术制备了恒河猴糖尿病模型，并将人胚胎胰腺干细胞分化胰岛分别移植到恒河猴的肝脏和肾包膜下。经过10只恒河猴，长达近4年的有效性和安全性的评价，课题组证实，人胚胎胰腺干细胞分化胰岛治疗糖尿病在恒河猴有效并且安全。
实验研究的成功并不意味临床应用的开始。在干细胞技术治疗糖尿病临床应用前必须解决一系列的技术问题如：采用多大胚胎的干细胞？干细胞体外扩增到多少数量？如何筛选分化后的功能胰岛？如何评价分化胰岛的安全性？干细胞分化胰岛移植到什么部位？移植多少胰岛数量？移植后进行哪些指标监控？等等。除此之外，还要申请通过医学伦理委员会的审批以及病人签署知情同意书。这些问题的解决都涉及主管部门、基础研究团队，临床研究团队和病人之间的密切合作和沟通。
近来的研究表明，来自人胚胎早期的干细胞系具有分化效率低和成瘤性高的缺陷，而来自成年人体的干细胞往往存在增殖能力低下的缺陷。而人胚胎组织来源的干细胞既具有很强的自我更新能力，有具有较好的分化潜能，并且我国学者曾经进行了近1000例的临床实验，证明用人胚胎胰腺组织移植治疗糖尿病有效。因此，娄晋宁团队决定采用人胚胎胰腺组织来源的干细胞进行这项研究，并通过医学伦理委员会审批和患者签署胚胎组织进行同意书解决了所涉及的医学伦理问题。
娄晋宁团队首先证实，来源于3个月内的人胚胎胰腺组织的干细胞，具有体外增殖能力较强，分化后成熟度较高的双重优点，并且在细胞移植后不发生免疫排斥反应。
此后，娄晋宁团队分别解决了这种干细胞的体外扩增、定向诱导分化和形成胰岛样结构三个技术难题，使一个人胚胎胰腺来源的干细胞可以在体外扩增到10个亿细胞，并且诱导分化后胰岛数量可以达到50万当量，胰岛素分泌功能相当于正常胰岛的50%。这些干细胞技术在数量和质量上的突破为临床应用奠定了基础。
基本的素质是锲而不舍
目前，干细胞的临床应用仅限于自体干细胞治疗，国内用此类干细胞治疗的疾病已达30种之多。自体干细胞移植的最大好处是安全，但多数治疗可能无效或短时间有效，并且相关的作用机制也没有搞清楚。
不同于自体干细胞移植，1型糖尿病的发病机制是自身免疫所导致的胰岛细胞破坏，并且临床研究研究证实采用胰岛细胞移植能够有效治疗1型糖尿病。因此，采用干细胞体外扩增和定向诱导分化技术所制备的胰岛移植，其治疗的机制就是胰岛细胞的替代治疗。到目前为止，采用这种干细胞技术治疗糖尿病在国际上还未见文献报道。
娄晋宁寄希望以基础研究学者要求的逻辑性以及临床研究者要求的精密性、完备性来控制研发节奏，回归医学临床治疗研发的理性轨道。
“其方法就是把自己的研究‘做实了’”。
据娄晋宁介绍，首例干细胞分化胰岛移植经过医学伦理委员会的审批，由患者签署了知情同意书，并接受免费治疗。移植所采用的干细胞经过功能筛选来自3个不同的胚胎，经过30天的体外扩增和定向诱导分化，培养的细胞达到140个培养瓶，诱导分化后的胰岛达到50万当量。目前，移植后的初步结果显示，干细胞分化胰岛移植后患者的血糖控制改善，胰岛素用量减少，进一步结果有待组织活检的证实。
干细胞移植是前沿研究，在研究的初始阶段，每一个探索都可能存在缺陷，任何技术和方法都有一个从不完善逐步到完善的过程。娄晋宁认为，对于发生率和死亡率高、又缺乏特异有效治疗手段的疾病，应当在确保安全性的前提下鼓励和支持探索创新。
2014年7月，中科院生物物理所刘光慧研究员研究组及其合作者分别在国际权威学术期刊《细胞-干细胞》（CellStemCell）和《自然-通讯》（NatureCommunication）连续发表了两篇重要研究论文，在确证现有基因组靶向编辑技术安全可靠性的基础上，创建了新型高效的人类遗传突变修复工具，并将其应用于镰刀形细胞贫血患者致病基因的靶向修复；同时利用人多能干细胞和基因组靶向编辑技术揭示了范可尼贫血的致病机理，首次提出多组织干细胞加速衰老或衰竭是其根本性病因，并基于此发展出相应的干细胞、基因和药物治疗策略。
人类诱导多能干细胞技术（iPSC）的出现，促进了人类基因组靶向矫正技术的快速发展，包括核酶介导的DNA同源重组技术（如ZFN、TALEN及CRISPR/CAS9等）和不依赖于核酶的大片段DNA同源重组技术（以第三代腺病毒载体HDAdV为代表）。经遗传修复的自体干细胞具有治疗自身疾病的潜力，因此在个体化医学和再生医学中具有广阔的应用前景。在CellStemCell杂志发表的论文中，研究者首次综合运用HDAdV、TALEN和CRISPR3种不同的方法，靶向矫正镰刀形细胞贫血患者iPSC中发生的血红蛋白基因（HBB）突变，发现这3种方法具有类似的打靶效率。同时，全基因组深度测序结果显示，TALEN和HDAdV在基因矫正过程中最大限度地保持了患者基因组的完整性，提示了这些方法的安全可靠。随后研究者整合TALEN和HDAdV作为基因组靶向修饰工具的独特优势，创建了效率远高于传统技术的新型人类疾病基因原位修复载体telHDAdV，为开展基于干细胞的基因治疗奠定了基础，也使得再生医学研究向前迈进了一大步。该研究打消了干细胞和再生医学研究领域针对疾病基因靶向修复安全性的忧虑，同时，新型基因矫正载体的问世也将有助于加速干细胞临床转化的步伐。CellStemCell杂志同期发表的了题为“What’sChangedwithGenomeEditing？”的Preview评论：“这些发现无疑会鼓舞将基因组靶向编辑技术进一步应用于疾病研究和临床治疗”。
另一方面，范可尼贫血属于先天再生障碍性贫血，是一种严重的常染色体隐性遗传疾病，尚无有效的药物治疗手段。在NatureCommunication杂志发表的论文中，研究者成功突破技术瓶颈，首次利用体细胞重编程获得患者体细胞来源的非基因组整合型iPSC，随后利用HDAdV介导的基因组靶向编辑技术，在患者iPSC中原位矫正了致病基因，并证明了该技术体系的安全性。尤为重要的是，研究者首次在人组织干细胞水平阐释了范可尼贫血的新型病因学基础，即不仅归因于造血干细胞的过早衰竭，还与骨髓造血微环境间充质干细胞的加速衰老密切相关。在疾病治疗方面，该研究利用干细胞疾病模型首次筛选得到了可抑制范可尼贫血患者造血干细胞过早衰竭的小分子化合物，为实现该病的药物治疗奠定了基础。
上述两项研究工作得到多项国家自然科学基金项目以及“973”计划资助。
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